抗坏血酸氧化酶的催化性能、酶学特征、功能与检测

介绍

抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AO，EC1.10.3.3)属于多铜氧化酶家族，定位于细胞壁，在植物界广泛存在。它能将抗坏血酸氧化为单脱氢抗坏血酸，从而调控植物质体外抗坏血酸库的氧化还原状态。AO 对植物的逆境响应、基因表达、生长发育和成花诱导都可起调控作用，这些调控机制均与质体外抗坏血酸库的氧化还原状态有关。

图一 抗坏血酸氧化酶

催化机制

抗坏血酸氧化酶定位于细胞壁，催化原生质体外的抗坏血酸(ascorbate， AA)和氧反应生成单脱氢抗坏血酸(monodehy droascorbate，MDHA)，MDHA 不稳定，而后转变为脱氢抗坏血酸(dehydroascorbate，DHA)，从而调节植物原生质体外抗坏血酸库的总体氧化还原状态。当AO活性升高时，质体外抗坏血酸库的氧化/还原比升高，在质膜两侧产生明显的氧化还原梯度。这种梯度能够影响植物的多种生理活动，包括调节生长发育、气孔开闭、胁迫响应、基因表达、激素反应、花期调控等。表明AO在植物的逆境应答和生长发育调控中可能起作用。

酶学特征

抗坏血酸氧化酶是一个同型二聚体铜蛋白，分子量为140kDa，共有2个亚基(每个亚基为70kDa)。对AO的晶体结构X-射线衍射分析表明，每个亚基大约有550个氨基酸残基，有3个结构域，分别是 Ser 31-Tyr 163 (结构域 1)、Asp 164-Ser 373(结构域2)和Asn 374-Pro 579(结构域3)。每个亚基含有4个铜原子，其中3个以三核铜簇(trinuclear copper)的形式存在于结构域1和3之间的交界处，而另外一个铜原子则以单核形式(mononuclear copper)存在于结构域1上。这个三核铜簇被认为是 AO 和氧结合并储存电子的位点。另一个铜原子则被认为是和抗坏血酸结合的位点。酚类化合物能够和这一位点相结合，因此可作为抗坏血酸的竞争性抑制剂，用来调节AO的催化活性。

分子生物学特性

抗坏血酸氧化酶的cDNA 最早从黄瓜中获得，而后陆续在南瓜、烟草中得到克隆。1994年，从黄瓜中分离到第一个AO的基因组DNA，而后在南瓜、甜瓜中也陆续克隆到 AO的基因组DNA。来源于不同植物的AO基因具有相似的结构。从南瓜(Cucurbita sp.)中克隆到的AO基因由4个外显子和3个内含子组成，其中外显子的序列与不同来源AO的cDNA上的对应序列一致。基因的结构也与黄瓜中的AO基因结构一致。其中内含子1位于结构域1中，内含子2和3位于结构域2中，而结构域3中没有内含子。这与黄瓜中AO的内含子定位是一致的。不同来源的AO基因具有不同的转录调控方式。推测AO基因的表达可受生长素或与伤害信号途径相关的分子的调控。AO属于一个小的多基因家族，如甜瓜中含有4个AO基因，而且具有不同的表达特性。

表达调控

光周期调节

抗坏血酸氧化酶在植物的光合组织中含量丰富，可能影响植物体内与光有关的生理变化。烟草中AO的表达量受光调节，在黑暗条件下其表达量降至极低水平，而恢复光照后，其表达量缓慢上升，表明AO的表达受光的诱导。但对光周期控制培养的烟草进行检测后却发现，AO的表达不受光周期节律控制。说明AO的表达仅受光的调控，而与植物自身的昼夜节律(circadian rhythmicity)无关。而能够催化DHA还原为AA的脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)的活性受光照强度控制，早晨6点活性较低，午后2点和4点则较高，以后逐渐下降。 DHAR和AO都受光的诱导，两者共同作用调节原生质体内外AA库的氧化还原水平，影响与光有关的植物体内生理变化。

激素调节

生长素类激素如NAA、2,4-D均能促进抗坏血酸氧化酶的表达量升高；而与胁迫信号途径相关的水杨酸(SA)分子则可引起AO的表达量下降。用不同生长调节物质处理甜瓜(Cucumis melo)后的结果显示，Cm AO4的表达量受 ABA、 IAA、SA和AA下调，受茉莉酸(JA)上调。二者都能改变 Cm AO4的表达量，表明AO参与生长调节物质诱导的植物生长发育调控。

铜离子调节

铜离子含量是影响抗坏血酸氧化酶合成的重要因素。在南瓜愈伤组织的培养基中添加铜离子后，抗坏血酸氧化酶的含量明显上升。抗坏血酸氧化酶的mRNA含量并没有发生明显的变化，铜可能在翻译水平上对AO的酶量进行调节。用铜离子处理甜瓜后，AO表达量则上升。这可能由于不同植物对铜离子具有不同的响应方式所致。

功能

抗坏血酸氧化酶基因在烟草中正义表达后的结果表明，抗坏血酸氧化酶过表达引起与AA循环有关基因的表达量下降，原生质体外氧化态的AA含量升高，使植物对氧化胁迫的耐受力降低。在烟草中正义表达抗坏血酸氧化酶基因，还会引起一个编码质膜上双孔钙通道基因(two-pore Ca²+ channel，NtTPC1B)表达量的明显下降。H2O2可激活门控电压钙通道NtTPC1B，已知NADPH氧化酶催化的氧化爆发(oxidative burst)能够产生H2O2，而NADPH氧化酶催化的氧化爆发与钙通道的激活相耦联。AO 基因的正义表达可能会引起类似于NADPH氧化酶催化后的效应，从而导致原生质体外的H2O2含量升高，钙通道激活，NtTPC1B的表达丰度降低[1]。

检测

当抗坏血酸氧化酶浓度从12 U/L 增加到 400 U/L 时，溶液颜色逐渐加深。随着AO浓度不断增大，652 nm 处吸光度值也逐渐变大。图二为吸光度值随AO浓度变化的关系曲线图。抗坏血酸氧化酶浓度在12 U/L~400 U/L范围内，溶液的吸光度值(y)与AO 浓度(x)之间呈良好的线性关系y=0.0513x+0.013(R2=0.9704)，检测限为3.2 U/L[2]。

图二 吸光度值随抗坏血酸氧化酶浓度变化的关系曲线图

参考文献

[1]石永春,刘卫群. 植物中的抗坏血酸氧化酶[J]. 植物生理学通讯,2008,44(1):151-154.

[2]潘蕊,黄伟华,李佳娜,等. 基于抗坏血酸调控氧化铈纳米酶催化活性的抗坏血酸氧化酶检测研究[J]. 分析科学学报,2024,40(4):389-394. DOI:10.13526/j.issn.1006-6144.2024.04.003