4-羟基异亮氨酸的应用与研究

概述

4-羟基异亮氨酸(4-Hydroxyisoleucine)是从葫芦巴种子中提取的活性成分，属于异亮氨酸的羟基化衍生物，具有特定的立体构型，简称4-HIL。4-羟基异亮氨酸的药理作用较为广泛，主要包括降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗等，因而作为传统中药成分被用于治疗2型糖尿病、血脂异常、代谢综合征以及脂肪肝等疾病^[1-2]。

提取方法

关于4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的提取，目前主要采用葫芦巴种子提取法生产，然而该方法提取效率低(0.091-0.6%)，且采用该方法获得的4-HIL构型较多但仅(2S,3R,4S)-4-HIL具有生物学活性^[3]。因此，生物技术领域报道了一种全细胞催化制备4-羟基异亮氨酸的方法，利用全细胞催化法制备4HIL。其中，全细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET28a为载体表达异亮氨酸双加氧酶，以异亮氨酸为底物构建全细胞催化体系进行转化反应，将转化液进行超滤，离子交换后，再经脱色，浓缩，干燥得到4HIL产品。该发明底物转化率可以达到98%，结合超滤和离子交换手段，产品中4HIL的纯度可以达到98%^[4]。

测定方法

实验建立葫芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量测定方法：采用反相高效液相色谱，柱前邻苯二甲醛衍生化法。Kromasil ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱为固定相，甲醇-0.05 mol·L^-1醋酸钠水溶液(pH=7.2，其中加入0.5%四氢呋喃)梯度洗脱(0 min～20 min，30：70；30 min，40:60)，检测波长为340 nm，柱温为30 ℃，流速为1 mL·min^-1。结果，4-羟基异亮氨酸在0.1848～3.696 μg与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999)，平均回收率=99.12%，RSD=2.15%(n=6)。该测定方法简便，准确，首次建立了葫芦巴药材的4-羟基异亮氨酸的邻苯二甲醛柱前衍生化含量测定方法，为葫芦巴质量控制及综合利用提供了依据^[5]。

应用

4-羟基异亮氨酸在药物合成领域具有重要应用，例如制备预防和/或治疗肿瘤的药物。在相关药物中，4-羟基异亮氨酸能够阻滞肿瘤细胞周期进程，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，缩小肿瘤体积，具有显著地抗肿瘤活性^[6]。此外，其在减肥药物或非酒精性脂肪肝保护药物或保健食品方面的设计与生产中也有应用，相关药物可以制作成口服制剂，胶囊剂，片剂或颗粒剂等。其中，4-羟基异亮氨酸可有效地降低体重，降低脂肪在体内的聚集，降低总胆固醇，甘油三酯，低密度脂蛋白在血浆中的含量，降低谷草转氨酶保护肝功能，改善脂肪肝，减少肝脏脂质的积累，可供需要治疗肥胖的人群安全有效地减重，降脂和保护肝功能^[7]。

有关研究

为了研究葫芦巴活性成分4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine，4-HIL)对高糖诱导的小鼠前脂肪细胞(3T3-L1)胰岛素抵抗的作用及其机制。研究人员以25 mmol/L葡萄糖加0.6 nmol/L胰岛素诱导小鼠3T3-L1脂肪细胞建立胰岛素抵抗细胞模型，予以不同浓度4-HIL(5，10，20 μmol/L)进行干预。采用[3H]-脱氧-D-葡萄糖摄入法检测葡萄糖摄取率，PCR法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)mRNA表达量，ELISA法检测细胞上清TNF-α蛋白水平。以棕榈酸(palmitic acid，PA)为对照。

结果，25 mmol/L葡萄糖加0.6 nmol/L胰岛素作用18 h后，3T3-L1脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运抑制了63%；PCR显示脂肪细胞内TNF-α mRNA的表达较正常脂肪细胞明显增高(P<0.05)；ELISA显示细胞上清中的TNF-α分泌量增加70 pg/mL(P<0.05)。PA组表现出类似结果。分别加入5，10，20 μmol/L 4-羟基异亮氨酸(4-HIL)作用24 h后，3T3-L1脂肪细胞胰岛素刺激所产生的葡萄糖转运分别增加35%，50%，60%；PCR检测显示，脂肪细胞内TNF-α mRNA的表达随着药物浓度的增加呈递减趋势，与模型组及PA组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，药物干预后脂肪细胞培养基上清TNF-α分泌水平分别下降10，18，39 pg/mL(P<0.05)。也就是说，4-HIL可以显著改善高糖诱导的小鼠3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗，同时4-HIL能够抑制TNF-α的分泌^[8]。

参考文献

[1]刘玲,丁永良,张国林.4-羟基异亮氨酸的研究进展[J].天然产物研究与开发, 2006, 18(3):6.DOI:10.3969/j.issn.1001-6880.2006.03.037.

[2]高峰,蔡琴,蔡伦,等.4-羟基异亮氨酸的研究现状[J].医药导报, 2014.DOI:CNKI:SUN:YYDB.0.2014-10-002.

[3]刘远.生物法合成4-羟基异亮氨酸的研究[D].天津科技大学,2019.

[4]陈晓双,宁健飞,蔡立明.一种全细胞催化制备4-羟基异亮氨酸的方法:CN202110584427.0[P].

[5]李波,曾光尧,谭健兵,等.柱前衍生化法测定葫芦巴中4-羟基异亮氨酸的含量[J].中南药学, 2009, 7(4):3.DOI:CNKI:SUN:ZNYX.0.2009-04-012.

[6]李国栋,袁保梅,祁园明,等.4-羟基异亮氨酸在制备抗肿瘤药物中的应用:CN202010789738.6[P].

[7]李国栋,杨佳丽,宋舒怡,等.4-羟基异亮氨酸的新用途:CN201711418956.3[P].

[8]余海,吴萌,卢芙蓉,等.葫芦巴4-羟基异亮氨酸对高糖诱导小鼠3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响[J].中国中西医结合杂志, 2013, 33(10):6.DOI:10.7661/CJIM.2013.10.1394.