RON抗体在受体酪氨酸激酶RON研究中的应用

RON（recepteur d'origine nantais，基因名为MST1R）是MET原癌基因家族成员，成熟蛋白由α链与β链经二硫键连接而成，配体为巨噬细胞刺激蛋白（MSP）^[1]。RON抗体是一类靶向RON受体酪氨酸激酶（又称MST1R）的单克隆抗体，主要用于肿瘤治疗研究。抗体的表位与特异性既决定数据能否被其他实验室重复，也决定样本间的横向比较是否成立。

RON抗体的表位归属

RON胞外区依次为Sema域、PSI基序和4个IPT域，其中Sema域的N端位于α链、C端位于β链，PSI与IPT域位于β链^[1,2]。现有RON抗体的识别位点并不重叠，Zt系列结合β链Sema域，PCM5B14结合β链PSI域，另有克隆针对IPT3域^[1]。这种差异在还原性电泳中会直接表现为条带位置的不同，针对Sema域N端的RON抗体倾向于检出α链，针对PSI或IPT域的则检出β链。实验中对α链分子量的记载在35 ku与40 ku之间不一致^[1,2]，还原条件与表位落点的差别是常见解释之一。

RON抗体在乳腺癌组织中的分层证据

以免疫组化、实时荧光定量PCR和Western blot检测了60例乳腺癌及对应癌旁组织、30例正常乳腺组织与30例乳腺良性肿瘤组织^[3]。结果显示RON在正常、癌旁及良性组织中低表达，在乳腺癌中高表达。RONΔ160在正常与癌旁不表达，良性组织轻微表达，癌中高表达^[3]。该研究特别说明RONΔ160抗体为特异制备，并单独用于免疫组化染色^[3]，说明变异体检测对RON抗体的表位专一性要求高于常规检出。

RON抗体家族谱系与功能分层

最早的RON单抗由Montero-Julian等于1998年免疫表达RON的MDCK细胞获得，此后IMC-41A10、IMC-RON8（Narnatumab）、07F01、29B06、18H09以及Zt/c1、Zt/g4、Zt/c9、Zt/f2等陆续报道^[1]。这些RON抗体在用途上已明显分层，一类用于免疫组化与免疫印迹的检出，一类用于阻断信号或递送药物^[2]。在后一类中，Zt/f2于荷HT29结肠癌裸鼠模型中抑制近50%的肿瘤生长，与氟尿嘧啶联用后抑制率提高到80%^[2]，其价值已明显超出单纯的检测工具。

RON抗体在功能研究中的角色

敲除RON可阻滞致癌信号传导并抑制癌细胞的浸润性生长，而在实验中使用Zt/g4或Zt/f2可使癌细胞中的RON大量富集，据此实现的靶向药物递送能增加药物对癌细胞的毒性^[4]。这类实验对RON抗体提出的要求不只是“能结合”，还包括结合后能否改变受体的内化与去向，这构成了检测型与功能型抗体之间的分界线。

RON抗体与抗体药物偶联物

抗RON-ADC的构建选用了诱导内吞效率良好的单克隆抗体，Zt/g4与PCM5B14分别识别β链的Sema域和PSI域，并经互补决定区嫁接实现人源化^[1]。对于RON高表达细胞系，携带药物的Zt/g4能在10~20 h内诱导50%的RON内吞，H5B14在10 h内即超过50%^[1]。在异种移植瘤模型中，20 mg/kg单次给药可使肿瘤生长完全抑制并在20~30 d内不出现再生^[1]。抗体诱导内吞的能力，因此从辅助参数上升为RON抗体的核心筛选指标。

RON抗体的实验参数参照

文献中可直接借鉴、用于RON抗体操作的条件包括：乳腺组织经4%多聚甲醛固定2 d后石蜡包埋，切片厚度4 μm，梯度脱蜡与抗原修复后封闭1 h，RON抗体一抗过夜，二抗按推荐浓度于37 ℃湿盒孵育20~30 min，PBS漂洗后以3%过氧化氢封闭10 min去除内源性过氧化物酶，DAB显色、苏木素复染^[3]。结果判读以阳性细胞百分数与染色强度的乘积计分，不高于2分为阴性，2~3分为弱阳性，4~6分为阳性，高于6分为强阳性^[3]。免疫印迹以Actin为内参，RON与RONΔ160在凝胶上呈现两条不同位置的条带^[3]，免疫荧光则可用于显示RON的细胞质定位^[1]。

RON抗体选择与验证的清单

RON目前至少已确定9个变异体，包括RONΔ160、Δ165、Δ155等^[2]，而全长RON与各变异体之间缺乏共享的识别表位^[1]。RONΔ160由第5、6外显子编码的109个氨基酸缺失造成，胞外半胱氨酸残基失衡导致自发二聚化与持续激活^[1,2]。因此RON抗体的选择应先确认免疫原落在α链还是β链、哪一个结构域，再以基因敲除或RNA干扰样本作阴性验证^[2,4]。用于变异体检测时，还需与全长RON共表达的样本对照，避免把异构体信号读成原型蛋白。

参考文献

[1] 孙婷, 姚航平. 靶向受体酪氨酸激酶RON的抗体药物偶联物及其抗癌作用[J]. 生物化学与生物物理进展, 2026, 53(6): 1638-1655.

[2] 马琪, 虞碧霞, 陈俊丰, 等. 受体型酪氨酸激酶RON及其在恶性肿瘤发生发展中的作用研究进展[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2016, 30(7): 784-789.

[3] 许国富, 黄国强. RON及其致癌型变异体RONΔ160在乳腺癌中的表达[J]. 中国现代医生, 2020, 58(2): 5-8,12.

[4] 余晓雯, 赵文权, 吴连俊, 等. 受体酪氨酸激酶RON在上皮源性肿瘤靶向治疗中的研究进展[J]. 中国肿瘤, 2016, 25(9): 711-714.