米瑟抗体延长液NC的应用

背景^[1-5]

Miser Antibody Extender Solution NC可以显著降低使用硝酸纤维素膜进行蛋白质印迹所需的初级的抗体量。蛋白质转移到硝酸纤维素膜后，Miser Antibody Extender Solution NC处理只需几分钟即可完成一抗孵育。Miser Antibody Extender Solution NC处理后的Western印迹化学发光和显色检测方法表现良好。

一抗抗体量的减少会减弱抗原特异性，而且Miser Antibody Extender Solution NC不建议用于转移到PVDF膜的抗原一抗孵育处理。Werstern blot，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后，通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（NC膜或PVDF膜）上，将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上，利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物，从而显示出待测蛋白的存在及量。

实验流程：

一.样本制备

样本的来源：细胞培养上清；细胞（胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；组织匀浆；蛋白的提取：（裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM）样本上样前的处理:蛋白提取液和SDS上样缓冲液（Loading buffer）以一定的比例上样；蛋白变性：95-100℃变性5分钟（为了能使抗体接触到抗原表位，必须将蛋白的三维结构打开，因此需要将蛋白变性，核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数，煮样时间延长至10-15min）。

二、上样与电泳

原理：裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。

上样：一般每孔上样20-50ug总蛋白，100ng纯蛋白。根据胶的厚度不同，上样总体积也不同：一般来说，10mm的胶最多可上样20ul；15mm胶最多上样30ul。

电泳：浓缩胶80V；分离胶120V（100V也可），电压越大分离越快，电泳时间一般1-2 h，电泳至溴酚兰即将跑出胶即可终止电泳。

三、转膜

一般分为：湿式电印迹-的转膜方法，半干式电印迹-可选的替代转膜方法，干式电印迹-有限灵敏度的转膜方法。

四、封闭

对转印膜空白位点的封闭，一般采用异源性蛋白质或去污剂封闭整张膜，常用5%脱脂奶粉、0.5%-2%BSA、10%血清（马/羊）和0.2%Tween20等。脱脂奶粉是常用的封闭剂，通常使用TBST+5%的脱脂奶粉但不能与生物素化的抗体一起使用，此时可以用BSA。使用辣根过氧化酶（HRP）标记的检测系统，封闭液后续不加叠氮钠（抑制HRP）。在含有封闭液的平皿中，接触胶的那面膜要朝上。

抗体孵育与检测：

孵育一抗：按要求用TBST/PBS稀释抗体，室温：1.5-2h，或者4℃过夜。孵育二抗：抗体的标记一般有酶标和荧光标记两种，室温：1.5-2h。显影，主要有：酶促底物DAB显色法（是HRP的常用底物），增强化学发光法（ECL）,荧光二抗显影法。最后用凝胶成像系统检测。

应用^[6][7]

Miser Antibody Extender Solution NC可用于急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究：

急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种异质性很强的恶性克隆性疾病,严重影响人类的健康。白血病多药耐药(multidrug resistance,MDR)的产生是导致化疗失败的关键因素,也是造成白血病患者复发、难治的重要原因。白血病多药耐药是指白血病细胞对一种化疗药物产生耐药后,同时对不同化学结构和不同作用机理的多种化疗药物产生交叉耐药的现象,包括原发性耐药与继发性耐药。

MDR产生机制非常复杂,包括药物外排介导的耐药、MDR相关酶类异常所致耐药、药物作用靶点基因突变、肿瘤干细胞、细胞凋亡受抑、周期阻滞、药代动力学的改变等。MicroRNA(miRNAs)是一类长度为19-25nt,序列高度保守的内源性非编码小RNA分子。成熟miRNA通过与目的基因3’端非编码(3’-UTR)区结合促使靶基因抑制或蛋白降解,在转录或转录后水平调控基因表达,广泛参与细胞的增殖、凋亡、分化、免疫系统、个体发育以及机体代谢等一系列生命过程。

Lipofectamine2000分别将miR-29b模拟物(mimic)或抑制剂(inhibitor)及各自阴性对照转染AML敏感与耐药细胞株,48小时后收集各组细胞,Real time RT-PCR检测转染后miR-29b表达情况。分别包装携带AF1q表达载体或AF1q shRNA的慢病毒,感染AML敏感或耐药细胞株,上调或下调AF1q表达,48小时后荧光显微镜观测感染效率,应用Blastin药物筛选获得稳定感染细胞,Real timeRT-PCR、Western blot方法检测病毒感染稳筛后AF1q表达情况。

参考文献

[1]Diverse roles of miR-29 in cancer(Review)[J].Hesong Jiang,Guang Zhang,Jun-Hua Wu,Chun-Ping Jiang.Oncology Reports.2014(4)

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[4]Acute myeloid leukaemia in adults[J].Felicetto Ferrara,Charles A Schiffer.The Lancet.2013(9865)

[5]miR-503 regulates the resistance of non-small cell lung cancer cellsto cisplatin by targeting Bcl-2[J].Tianzhu Qiu,Li Zhou,Tongshan Wang,Jing Xu,Jian Wang,Wenjiao Chen,Xin Zhou,Zebo Huang,Wei Zhu,Yongqian Shu,Ping Liu.International Journal of Molecular Medicine.2013(3)

[6]MiR-181a enhances drug sensitivity in mitoxantone-resistant breast cancer cells by targeting breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2)[J].Xuyang Jiao,Lin Zhao,Mengtao Ma,Xuefeng Bai,Miao He,Yuanyuan Yan,Yan Wang,Qiuchen Chen,Xinnan Zhao,Mingyi Zhou,Zeshi Cui,Zhihong Zheng,Enhua Wang,Minjie Wei.Breast Cancer Research and Treatment.2013(3)

[7]卢菲.急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究[D].山东大学,2014.