大鼠小肠上皮细胞的制备方法

发布日期:2020/10/18 17:56:53

背景及概述^[1]

上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性，一面朝向身体表面或腔面，称游离面;一面向着深部的结缔组织，称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时，则影响机体的防御功能。小肠上皮细胞(intestinalepithelialcell，IEC)是哺乳动物消化吸收的主要功能细胞。以往对上皮细胞的在体试验多侧重临床、病理及超微结构等方面的研究，离体试验多为利用细胞系进行药物筛选以及肿瘤治疗等。体外分离得到的大鼠小肠上皮细胞的分化特性的维持对于研究小肠吸收功能非常重要。1985年Quaroni和May建立了永久小肠上皮细胞系。正常的和转化的细胞系不能作为真正正常的上皮细胞来研究，因为这些细胞已经发生变化，并具有了永久生长的特性。采用大鼠小肠上皮细胞进行原代培养研究可较接近天然状态。

制备^[1]

1.小肠上皮细胞分离步骤：

(1)大鼠经断头处死(如果是孕鼠则剖宫取出胎鼠)后，用70%乙醇溶液浸泡大鼠1min以消毒。

(2)无菌条件下，经腹正中切口取出小肠。将小肠置于无菌的和无钙镁的Hanks清洗液中，仔细去除肠系膜。用Hanks液冲洗肠管，再用眼科剪刀纵行剪开肠管，洗净黏膜表面的黏液。

(3)将肠管剪成2～3mm的组织块，用Hanks液清洗2min，再剪成1mm3小块。加入20ml酶消化液(胶原酶Ⅸ型和中性蛋白酶Ⅰ型配合使用，终浓度分别为300Uml和1mgml)，于37℃下振荡消化30min或更长时间。

(4)用吸管轻轻反复吹打组织块3～5min，以1000rmin离心5min，弃酶消化液。再用Hanks液反复吹打，重新悬浮沉淀的肠绒毛组织。在倒置显微镜下检查，可见悬浮液主要由未分散的小肠隐窝器官样细胞团(organoids)、分散的单个黏膜上皮细胞和成纤维细胞等组成。

(5)将分散的单个黏膜上皮细胞和肠隐窝细胞团移入25ml分离管(可用离心管代替)。每管加入10ml组织分散液(DMEM分离溶液含5%FCS、2%山梨醇)，吹打均匀，静置1min。收集含单个细胞和肠隐窝细胞团的上清液。

(6)重复上述过程3次以上，最后收集上清液，去掉沉淀。将上清液离心(1600rmin，3min)，取沉淀重新悬浮在20ml的组织分散液中。重复3次以上，去除碎片，使得到的上皮细胞更纯。

(7)用培养液悬浮沉淀细胞和肠隐窝细胞团后，种植于胶原蛋白包被的培养板或瓶中。于37℃、5%CO2培养箱中培养48h后，更换培养液。以后每3d换液1次。

2.形态学检查

倒置显微镜下观察细胞生长状态。用台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞，确定其生长活力。

3.免疫细胞化学染色定性鉴定上皮细胞

(1)玻璃盖片处理：灭菌、以鼠尾胶原包被后，把细胞培养在盖玻片上。

(2)漂洗：在温PBS中漂洗3次，每次30秒，吸干。投入甲醇∶丙酮=1∶1(体积比)固定10min。

(3)染色：用温PBS漂洗3次，每次1min，吸干。投入冷丙酮中(-10～-20℃)，令细胞面向上，固定7min。用温PBS彻底漂洗3次，每次1min。

(4)取干净的培养皿，向中央滴一滴一抗(抗细胞角蛋白抗体，购自丹麦Dako公司)[用0.01molLPBS和0.5%BSA(Sigma公司产品)稀释一抗到1∶50～1∶100]，将小盖玻片细胞面向下扣在抗体上，盖好皿盖，20℃孵育2h。阴性对照组同时加入等量的PBS代替一抗，其余步骤相同。

(5)漂洗：向碟皿内徐徐加入PBS，令盖片浮起在液面，夹出。温PBS漂洗3次，每次1min。

(6)同样方法加入生物素标记的二抗(购自北京中山生物技术公司)20℃孵育1h。

(7)漂洗：方法同(5)。最后，经DAB显色后用PBS彻底冲洗，蒸馏水洗几次。脱水、二甲苯透明。封片，观察。

3.结果

倒置显微镜下可观察到经过消化、离心处理的小肠黏膜悬液主要由隐窝样上皮细胞团构成;通过台盼蓝染色鉴定，经胶原酶Ⅸ型和中性蛋白酶Ⅰ型联合消化分离后细胞的存活率可达95.7%。去掉的沉淀中(提取过程的第6步)有未被分散的上皮细胞和弹性纤维(图1)。经原代培养的肠黏膜上皮细胞，24～48h可见贴壁;4～6d形成一群一群细胞集落(图2);10～12d细胞汇合成片。细胞为多角形单层生长，呈“铺路石样(pavement_like)”(图3)，细胞边界清楚，互不重叠[3]，胞浆丰富，核为圆形或卵石状，核内染色质稀疏空亮，核仁1～2个。显微镜下还可见少量平滑肌细胞、成纤维细胞及神经胶质样细胞。本实验所用细胞并未进行传代培养。细胞角蛋白为上皮组织的特征性抗原成分，本实验选用生物素标记的细胞角蛋白抗体来定性显示大鼠的小肠上皮细胞。免疫细胞化学结果显示小肠上皮细胞为阳性(棕色)(图4)，阴性对照组不显色(图5)。