PFU DNA聚合酶的应用

背景^[1-6]

PFU DNA聚合酶是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis分离出的高保真耐高温DNA聚合酶，分子量为90 kDa，具有3’→5’外切核酸酶活性，无5’→3’外切核酸酶活性，其扩增产物为平末端，无突出的A。DNA聚合时延伸速度为600 bp/min；PCR产物为平末端。其他高温DNA polymerase，如：Vent、DeepVent、Tli、UlTma等具有校正功能，但是Pfu是目前已发现的所有DNA聚合酶中扩增DNA时出错率最低的。Pfu DNA聚合酶比普通的Taq DNA聚合酶热稳定性更好，95°C、1 h仍保持90%以上的活力。

与其它在PCR反应中使用的聚合酶相比，Pfu聚合酶有着出色的热稳定性，以及特有的“校正作用”。与TaqDNA聚合酶不同，PfuDNA聚合酶具有3'-5'外切酶的即时校正活性，可以即时的识别并切除错配核苷酸。因此，使用PfuDNA聚合酶进行PCR反应，比使用Taq聚合酶有较低的错配突变几率，保真性更高。Pfu聚合酶正逐渐取代Taq聚合酶，成为使用最广的PCR工具。

商业化的Pfu聚合酶试剂，其出错率是100万到130万个碱基对出现一个错配，使用PCR每扩增1kb的DNA片段会产生2.6%的突变产物。但缺点是，Pfu聚合酶的效率较低。一般来说，在72°C扩增1kb的DNA时，每个循环需要1到2分钟。而且使用Pfu聚合酶进行PCR反应，会产生钝性末端的PCR产物。Pfu聚合酶常常用于保真性要求较高的DNA合成中。有报道说，Pfu聚合酶与Taq聚合酶联合使用，既能达到Pfu聚合酶的高保真性，又能发挥Taq聚合酶的快速聚合活性。

Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端，无3’端"A"突出，其PCR产物的克隆有两种方案：

1.PCR前引物进行5’端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平滑末端的载体中。

2.将产物3’末端加A后再与T-Vector连接。

3.由于Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3′端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度，理想的引物长度为20-30碱基。另外为了减少由3′-5′外切酶活性引起的引物降解，尽量在冰上配置反应体系，并最后加入Pfu酶。

应用^[7][8]

PFU DNA聚合酶可用于要求保真度比较高的PCR反应，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成：

Pfu DNA聚合酶来源于古细菌Pyrococcus furiosus,该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50),为多聚体,分子量约为90kDa。该酶同时具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切核酸酶活性,因此在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基,忠实性极高。Sso7d是来源于SuIfolobus solfataricus的一种双链DNA结合蛋白,与DNA聚合酶融合后,聚合酶的进行性得到了显著的提升,而其对聚合酶催化活性和热稳定性没有影响。

本研究通过在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达.Pfu DNA聚合酶与Sso7d融合蛋白(pfusso蛋白),成功地开发了Pfu DNA聚合酶表达的新方法。基因被克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A,获取重组质粒。由于该载体含有醇氧化酶启动子,因此异源蛋白在毕赤酵母中的表达能被严谨地调控。然后将重组质粒线性化后电击转化至毕赤酵母GS115菌株,涂布于MD平板,随机挑取转化子,摇瓶培养,加入终浓度为0.5%的甲醇诱导蛋白表达,在不同诱导时间段取培养基上清液进行SDS-PAGE检测。

将提取的粗酶液进行酶活性检测。结果表明,本研究成功实现了pfusso在毕赤酵母菌中的分泌性表达。用Bradford蛋白浓度测定方法法测定其表达量约为187mg/L,该酶的扩增性能、扩增产物产量和热稳定性要优于大肠杆菌表达的pfusso,但是扩增产物的忠实性相对较低。本研究利用毕赤酵母成功表达了一种高保真热稳定性DNA聚合酶,节约了高保真DNA聚合酶的生产成本,简化了纯化步骤,为利用毕赤酵母规模化生产热稳定性DNA聚合酶打下了良好基础。

参考文献

[1]Molecular Genetic Testing of Hemophilia A[J].Anne Goodeve.Semin Thromb Hemost.2008(06)

[2]Quantitative RT-PCR Detection of Colorectal Tumor Cells in Peripheral Blood—A Systematic Review[J].Gregory Sergeant,Freddy Penninckx,Baki Topal.Journal of Surgical Research.2008(1)

[3]The PCNA–RFC Families of DNA Clamps and Clamp Loaders[J].Jerzy Majka,Peter M.J Burgers.Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology.2004

[4]SNP discrimination through proofreading and OFF-switch of Exo+polymerase[J].Jia Zhang,Kai Li,Jose R.Pardinas,Duan F.Liao,Hong J.Li,Xu Zhang.Molecular Biotechnology.2004(1)

[5]Single-base discrimination mediated by proofreading 3′phosphorothioate-modified primers[J].Jia Zhang,Kai Li.Molecular Biotechnology.2003(3)

[6]Optimizing Functional versus Total Expression of the Humanμ-Opioid Receptor in Pichia pastoris[J].Valérie Sarramegna,Pascal Demange,Alain Milon,Franck Talmont.Protein Expression and Purification.2002(2)

[7]Optimizing scale-up fermentation processes[J].Michel Thiry,Doriano Cingolani.Trends in Biotechnology.2002(3)

[8]The cell membrane plays a crucial role in survival of bacteria and archaea in extreme environments[J].Wil N.Konings,Sonja-Verena Albers,Sonja Koning,Arnold J.M.Driessen.Antonie van Leeuwenhoek.2002(1)

[9]]赵慧.PfuDNA聚合酶在毕赤酵母中的表达与功能验证[D].湖北大学,2012.