青霉素酶的主要应用

背景及概述^[1]

青霉素酶是一种作用于青霉素的β-内酰胺环，使青霉素变成无抗菌活性的青霉酮酸的酶。多种青霉素耐药细菌能产生此酶。如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的青霉素耐药菌株和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的青霉素耐药株等。本酶是一种医疗用酶，适用于治疗一般青霉素的过敏反应，也可用于过敏性休克或严重青霉素过敏反应症患者的辅助治疗。蜡状芽孢杆菌可作为此酶的生产菌种。

结构^[2]

组成青霉素酶的氨基酸有赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、撷氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。

性质^[2]

青霉素酶能被乙醇、丙酮沉淀变性，能被高热破坏，能被硫酸钱盐析沉淀，等电点为5.4。提纯后的青霉素酶1mg蛋白的比活性可达单位14*10⁶，适宜pH为6.8-7.2。

1）稳定性：对于发酵后的青霉素酶，标准的药典发酵方法，其酶液能够在4℃保存6个月以上，其活性与同时采用加入甘油或增加氯化钠浓度保护酶活性的方法比较，没有显著的不同。但如果在发酵的酶活性非常高时，在4℃保存的月内，酶活性可有一定的下降，之后可以有同样的保存稳定性。发生此现象的原因可能与高活性下蛋白质分子间的相互作用有关。

2）底物特异性：青霉素酶对大多数一内酰胺抗生素有酶解能力，蜡样芽抱杆菌产生的青霉素酶对青霉素类中青霉素G、青霉素V、氨苄西林、羧苄西林和磺胺西林具有非常强的水解作用，对阿莫西林、苯哩西林和吠节西林有轻微的水解作用，但对头袍菌素类抗生素头孢噻吩、头饱唑啉、头孢拉定、头孢氨苄、头孢呋辛和头噻肟均无水解作用。

应用^[2]

细菌产生青霉素酶是导致细菌出现耐药性的主要原因，利用青霉素酶具有水解β-内酰胺类抗生素的特点，可用于环境中残留青霉素的清除、医疗器械残留青霉素的清除、抗生素药品质量检验和新抗菌药物筛选、对牛奶中的青霉素残留量的快速定量测定和对青霉素超标牛乳进行处理等，国外在世纪年代中期就开展了青霉素酶固定化及处理青霉素超标牛乳的研究。近年对青霉素酶生物传感器的研究也非常活跃由于青霉素酶具有价格低廉和灵敏度高等优点，其可在酶联免疫吸附试验中替代传统的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。所以以青霉素酶为记酶的的测定对象不断扩大，女母激素、病毒、细菌和微生物抗原。

制备^[3]

1）青霉素酶溶液的制备

取菌的斜面培养物，接种至80mL培养基内，37℃摇床培养18h后，将培养物接种至其余各瓶90mL培养基内，每瓶接种10mL，同时加入无菌青霉素4500单位，37℃摇床培养24h，补加无菌青霉素2万单位，继续培养24h，再加无菌青霉素2万单位后培养24h，离心沉淀菌体，调节pH值至8.5，用滤柱滤过除菌，滤液调pH值近中性后，分装于适宜的容器内，10℃保存备用。

2）青霉素酶稀释液的制备

取青霉素酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液（pH7.0）稀释成每1mL中约有青霉素酶8000~12000单位的溶液，在37℃预热。

3）酶活力的测定[4]

精密量取青霉素溶液50mL，置100mL量瓶中，预热至37℃后，加入已预热的青霉素酶稀释液25mL，迅速混匀，在37℃准确放置1h，量取3mL，立即加至碘滴定液（0.005mol/L）（精密量取碘滴定液（0.05mol/L）10mL置100mL量瓶中，用醋酸钠缓冲液（pH4.5）稀释至刻度）25mL中，在室温暗处放置15min，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定。至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失。

空白试验：取已预热的青霉素溶液2mL，37℃放置1h，加入上述碘滴定液（0.005mol/L）25mL，然后加青霉素稀释酶稀释液1mL，室温暗处放置15min，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定。按下式计算：

式中：E为青霉素酶活力，U/（mL·h）；B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，mL；A为供试品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，mL；M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；F为相同条件下，每1mL的上述碘滴定液（0.005mol/L）相当于青霉素的效价，为742；D为青霉素酶溶液的稀释倍数。酶活单位定义为上述反应条件下，每小时生成1单位青霉素噻唑酸所需的酶量。

对霍氏肠杆菌WM1发酵培养条件的研究结果表明，最适发酵温度37℃，初始pH值为7.0，接种量10%。在以2.0%葡萄糖为碳源、0.3%酵母粉为氮源、0.010%Mg2+时产酶活力最高为1.15×104U/（mL·h）。

主要参考资料

[1] 微生物学词典

[2] 青霉素酶的制备及研究应用

[3] 霍氏肠杆菌WM1产青霉素酶发酵条件的研究