异嗪皮啶的生物发酵及其含量测定

前言

刺五加为五加科植物刺五加〔Eleutherococcus senticosus(Rupr.et Maxim.)Maxim.〕的干燥根或茎，又名五加参、刺拐棒，作为传统中药材应用已久。刺五加活性成分主要有氨基酸类、微量元素、糖类、木脂素类、香豆素类、黄酮类等，具有益气健脾、补肾安神的功效，用于脾肺气虚、体虚乏力、食欲不振、心脾不足、失眠多梦等。现有刺五加的相关制剂以刺五加注射液与提取物为主，临床主要用于治疗肝肾不足所致的短暂性脑缺血疾病，也用于治疗冠心病、心绞痛合并神经衰弱和更年期综合症等。刺五加作为东北地区的道地药材，更有“寒地龙药之首”的美称，具有较高的产量。然而，刺五加的天然异嗪皮啶含量较低，长期以来，其资源未能得到充分合理的开发与利用。

异嗪皮啶是一种存在于多种植物中的香豆素类化合物。高纯度的异嗪皮啶为白色结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、氢氧化钠溶液，难溶于冷水。异嗪皮啶作为中药刺五加的主要活性成分之一，具有镇静催眠、抗炎、抗氧化等功效，但在刺五加中的含量很低，大部分以结合的糖苷形式存在，即刺五加苷B1，可通过a-葡萄糖苷酶转化为异嗪皮啶，如下所示。

为避免中药资源的浪费，现阶段多采取酸碱水解法、生物转化法、多聚体转化法等方法转化合成异嗪皮啶。其中，酸碱水解法的设备损耗大、反应剧烈，对生态环境造成一定的损害;生物转化法又可分为酶促转化法和微生物发酵转化法，前者具有反应特异性强、条件温和、操作简便、环保安全等优点，可定向转化中药原料，提升目标产物的纯度和活性成分含量。然而，由于酶的制备和纯化过程复杂且昂贵，导致其成本较高。此外，酶的活性和稳定性易受环境条件影响，需精确控制，且酶促转化法通常仅适用于特定底物，处理复杂混合物的能力有限。相比之下，微生物发酵转化法能够在更宽松的条件下高效处理复杂混合物。通过微生物自繁殖提供所需酶类，避免了昂贵的酶制备，并且能够实现多步骤转化，提高产物得率和生产效率，适合大规模工业化生产。管立军等成功使用植物乳杆菌发酵提高了异嗪皮啶含量。然而，微生物发酵也存在产物收率不稳定、转化效率受限等问题。离子液体(IL)在室温下以液体形式存在，是由一种无机阴离子和有机阳离子或有机阴离子和有机阳离子组成的，具有不对称取代基的有机盐类物质。离子液体具有蒸汽压不显著、热稳定性好、理化性质可调、毒性作用低甚至无毒等优良特性，可作为传统挥发性有机溶剂的优良替代品，作为催化剂辅助酶促反应和全细胞生物转化。离子液体通过增强微生物对底物的利用率，提高发酵效率，缩短生产时间，从而有效弥补传统发酵法的缺陷。洪立伟等研究表明，离子液体可以显著改善微生物的生物转化，保证酶良好的活性，增强酶的稳定性，使底物和酶充分接触，解除底物竞争抑制，大幅提高产物的收率。

本文拟以刺五加为原料，通过离子液体辅助发酵菌进行生物转化，优化刺五加的最佳生物转化条件，考察离子液体辅助发酵菌转化过程中异嗪皮啶含量的变化，提升其产量，以期为异嗪皮啶的规模化生产和食品工业应用提供可行策略。

发酵制备方法^[1]

1、异嗪皮啶的生物转化

将刺五加粉碎后烘干，过筛(65目)，得到刺五加粉末，经灭菌处理(121℃，20min)后，置于4℃冰箱中保存备用。将刺五加粉末1.000g加入到含有0.4mol/L离子液体的MRS培养基的锥形瓶中，消毒杀菌。然后,在MRS培养基内活化好的菌中加入一定量的无菌水，制成1x10⁷CFU/mL的菌悬液。最后,将500uL细菌悬液加入到锥形瓶中，在36°C、130r/min的条件下振荡培养24h，进行发酵。

最佳的发酵菌种为植物乳杆菌；最佳的离子液体为[C4MIM]Br。最优反应条件为pH=6.0、液固比为25∶1、发酵温度36.5℃、发酵时间36h、[C4MIM]Br浓度0.57mol/L。在此条件下，异嗪皮啶产量为0.257mg/g。

2、异嗪皮啶的超声提取

取发酵24h后的发酵产物，置于自动电热压力蒸汽灭菌器中高温(121℃)、高压(0.12MPa)灭菌20min，待自然冷却后，放入90°C恒温烘箱，干燥48h。待完全干燥后，以体积分数80%的甲醇水溶液为提取溶剂，超声提取30min，减压抽滤，过0.22um滤膜，得到异嗪皮啶提取原液。

最优反应条件为甲醇体积分数100%、超声功率480W、液固比19∶1、超声时间39min。在此条件下，异嗪皮啶产量为0.312mg/g。

含量测定

采用HPLC测定异嗪皮啶提取原液中异嗪皮啶的含量。采用HPLC,Positisil^Ⓡ ODS-P 120A色谱柱(4.6mmx25mmx5um)，检测波长为343nm,流动相为体积比20:80的乙腈/质质量分数0.1%磷酸溶液，柱温25℃，流速1mL/min。

称取异嗪皮啶，用甲醇定容，制成质量浓度为1g/L溶液，稀释得到不同质量浓度的溶液。过0.22um滤膜后保存在1.5mL瓶中，平行进样3次，测定峰面积，以异嗪皮啶的质量浓度(x,g/L)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标，建立线性回归方程，得到标准曲线的方程为:y=17123x+0.7136，R²=0.9998[1]。

参考文献

[1] 金爽,赵华勇,任裕斌,等. 离子液体辅助植物乳杆菌发酵刺五加制备异嗪皮啶工艺优化[J]. 精细化工,2025,42(11):2482-2492. DOI:10.13550/j.jxhg.20240769.