半乳糖氧化酶的制备与应用

简述

半乳糖氧化酶(GAO)是一种重要的生物催化剂，具有催化效率高和绿色环保的特点，在生物传感器，食品，医疗和化工等领域得到广泛应用。然而，天然的半乳糖氧化酶存在稳定性差，催化效率低，回收成本高等缺陷，限制了其在食品安全和生物医学等领域的应用。随着基因工程和蛋白质工程的发展，人们可以对半乳糖氧化酶进行有目的的改造，以提高酶的性能或者获得新功能的重组酶。因此，追求具有重要催化能力和强大功能的半乳糖氧化酶成为研究热点^[1]。

制备方法

酶催化技术领域报道了一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法。通过利用2‑甲基咪唑和金属盐分别制备A液和B液，并将半乳糖氧化酶先与A液混合，然后加入交联剂，最后与B液混合等一系列操作制得金属有机骨架材料固定化半乳糖氧化酶，所得固定化半乳糖氧化酶稳定性好，可以回收重复使用，在使用过程中对酶损伤小，在重复使用10批次后酶活仍能够达到最初批次酶活的87%^[2]

生物电化学特性

采用循环伏安法对半乳糖氧化酶进行生物电化学特性的研究。实验结果表明，由于半乳糖氧化酶的酶活性中心深埋在酶内部，所以该酶在铂电极上的直接电化学行为较难观察到，而二茂铁甲醇作为介体能明显地改善酶活性中心的电子传递，加快电子传递速率，且测定得到半乳糖氧化酶与二茂铁甲醇之间的反应速度常数Ks为1.2×10⁵L·mol^-1·s^-1[3]。

应用

综合大量文献研究，半乳糖氧化酶的应用极为广泛，下面就其部分应用实例展开详细介绍：

医药领域

半乳糖氧化酶-雪夫氏 (GO-S)试验是一种对大肠癌及癌前病变理想，敏感的标志物，可用于大肠癌及癌前病变的筛查和普查。实验表明，GO-S试验在各种大肠癌和癌前病变中的阳性率超过80%，其对大肠癌和癌前病变的特异性和敏感性分 别为98%和86%，阳性预示值为90%^[4]。生物医药研究方面还公开了一种抗炎可注射的含酶水凝胶得制备方法，其以半乳糖氧化酶和过氧化氢酶的级联酶催化反应为引发体系，以瓜尔胶，乙二醇壳聚糖为成胶单元，通过级联酶催化结合多糖分子动态交联的成胶方法制备。制备得到含酶水凝胶对多种活性氧和活性氮具有清除和抑制能力，在炎症微环境中能够发挥有效抗炎作用，此外还具有制备方法简单，反应条件温和，生物相容性好，具有自我修复能力，是一种极具前景的生物活性凝胶材料^[5]。

分析化学领域

文献报道了一种粘蛋白型O连接糖基化(OGalNAc型)检测方法，其基于生物酶选择性氧化生物正交化学反应相结合的策略，利用半乳糖氧化酶将半乳糖-6-羟基特异性氧化为醛基，通过酰肼化学实现了糖肽的特异性捕获与释放，并利用基于质谱的检测方法实现了OGalNAc糖型高灵敏度分析，可以从50μL的人源血清中检测到59个OGalNAc型糖基化修饰序列，对应超过30个O糖化蛋白上。该方法具有检测灵敏度高，富集特异性高等特点，是对现有的内源性OGalNAc型糖基化蛋白/肽段分析的重要手段^[6]。

传感器领域

在镀铂的玻碳电极表面，修饰一层全氟代磺酸酯(Nafion)膜，制成基底电极。用化学交联法将半乳糖氧化酶(GAD)固定在基底电极表面，即制成半乳糖传感器。和光亮铂相比，,镀铂电极对过氧化氢有更高的响应，而Nafion膜可以消除抗坏血酸，尿酸等电活性物质对测定的影响，提高了酶电极测定的选择性。D-半乳糖测定的线性范围为0.25~4.25 mmol/L，响应时间小于30s。电极连续使用300次，没有明显的电流变化。该电极具有快速，准确，选择性高的特点^[7]。

参考文献

[1]夏光丽,曹娜,孙慧慧,等.半乳糖氧化酶的生物学改造研究进展[J].生物技术通报, 2024, 40(1):176-185.DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0699.

[2]曹永军,高秀珍,马钦元,等.一种制备固定化半乳糖氧化酶的方法及应用:202410100687[P].

[3]贾能勤,朱燕,江丽萍,等.半乳糖氧化酶的生物电化学特性[J].上海师范大学学报：自然科学版, 2002, 31(4):4.DOI:10.3969/j.issn.1000-5137.2002.04.008.

[4]覃健,张琴.应用半乳糖氧化酶检测大肠癌及癌前病变的临床价值[J].中华肿瘤杂志, 1997, 19(2):3.DOI:CNKI:SUN:ZHZL.0.1997-02-037.

[5]廖悦,杨淇,李新志,等.一种抗炎可注射的含酶水凝胶及其制备方法和应用:CN202411684922.9[P].

[6]叶明亮,由昕,秦洪强.一种基于化学酶促的人血清O糖基化鉴定方法:CN201811325625.X[P].

[7]纪学锋,章咏华.以Nafion修饰的镀铂玻碳电极为基底的半乳糖传感器的制备[J].分析化学, 1993, 21(5):4.DOI:CNKI:SUN:FXHX.0.1993-05-005.