小鼠原代肝星状细胞

背景^[1-6]

小鼠原代肝星状细胞（HSC)位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞。

肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。

肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSC）是肝脏特异性间充质细胞，占肝细胞的5~8％。肝星状细胞在肝细胞外基质的稳态，修复，再生和纤维化以及控制视黄醇代谢中发挥重要作用。在健康肝脏中，肝星状细胞处于休眠状态，含有大量维生素A脂滴，构成体内的维生素A储库。当肝脏受损时，HSC可以转变为活化状态，其特征在于增殖，收缩性和趋化性

。受损肝脏中维生素A的含量会逐渐减少。活化的肝星状细胞还分泌胶原瘢痕组织，可导致肝硬化。在慢性肝病中，长期和反复激活星状细胞会引起肝纤维化。肝星状细胞的原代培养是研究肝纤维化的有价值的工具。

细胞特性:

1)组织来源于实验动物的正常肝组织。

2)细胞鉴定：结蛋白（Desmin)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：长梭状，星状细胞，贴壁培养。

应用^[7][8]

小鼠原代肝星状细胞可用于自噬和长链非编码RNA MEG3对IGFBPrP1激活肝星状细胞的调控及其机制的研究：

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是来源于间质的一种肝脏非实质细胞,HSCs的激活是引起肝纤维化发生的关键环节。多种细胞因子参与其活化,其中转化生长因子(transforming growth factor beta1,TGFβ1)发挥着举足轻重的作用,在活化的初期及末期通过直接或间接方式持续激活HSCs,HSCs激活后可使肝脏内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成和降解失衡,最终导致肝纤维化。

细胞自噬是指细胞在各种因素的作用下,细胞对其内部受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和侵入的病原体进行降解的生物学过程。现已证实,自噬在肝纤维化中发挥重要作用。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一种转录长度超过200核苷酸的RNA,母系表达基因3(materally expressed gene 3,MEG3),是最先发现的具有肿瘤抑制功能的lncRNA,其在肝癌组织中的表达量低于正常组织约200倍,且在肝纤维化中也发挥重要作用。

目前已知最强的致肝纤维化因子TGFβ1可诱导肝纤维化形成过程中伴有HSCs自噬的发生,可影响肝纤维化过程中lncRNA MEG3表达。既然IGFBPrP1与TGFβ1之间可以相互调控,那么IGFBPrP1是否也可以像TGFβ1一样诱导HSCs发生自噬,并且影响lncRNA MEG3的表达,从而影响肝纤维化的发生发展,目前国内外尚未见报道。自噬受多条信号通路调控,其中PI3K/Akt/mTOR信号通路是主要的调控通路之一,HSCs的激活同样受多种细胞因子和多条信号通路调控。

研究发现IGFBPrP1可能通过PI3K/Akt信号通路发挥致纤维化作用。那么IGFBPrP1是否可以通过引起Akt、mTOR磷酸化,进而调控自噬,从而促进HSCs激活,目前尚不清楚。P53是一种抑癌基因,lncRNA MEG3可通过与P53相互结合,发挥抑癌作用,那么IGFBPrP1、lncRNA MEG3与P53三者关系如何,目前尚未见报道。选用大鼠原代HSCs作为研究对象,其原因是由于原代细胞生物性状较稳定,可程度反应机体内原始状态。

使用腺病毒介导的IGFBPrP1基因转染大鼠原代HSCs,使用自噬促进剂雷帕霉素或抑制剂3MA干预大鼠原代HSCs,研究IGFBPrP1在激活HSCs过程中对自噬的影响及其作用机制。选用JS-1(小鼠肝星状细胞株)作为研究对象,其原因是使用JASPAR数据库预测MEG3与P53的结合位点,发现二者在小鼠与人中有结合位点,而在大鼠中无结合位点。

使用质粒载体构建的pcDNA3.1-MEG3过表达MEG3,使用针对MEG3设计的shRNA-MEG3基因沉默MEG3表达,研究IGFBPrP1、lncRNA MEG3与P53三者之间的关系。以此阐明自噬和lncRNA MEG3对IGFBPrP1激活HSCs的调控及其机制,为早期诊断及防治肝纤维化寻找有效靶点提供实验依据及理论基础。

参考文献

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[7]Transforming growth factor beta1 and aldosterone[J].Kota Matsuki,Catherine K.Hathaway,Albert S.Chang,Oliver Smithies,Masao Kakoki.Current Opinion in Nephrology and Hypertension.2015(2)

[8]周玉政.自噬和长链非编码RNA MEG3对IGFBPrP1激活肝星状细胞的调控及其机制的研究[D].山西医科大学,2018.