石蜡包埋DNA样本修复试剂

背景^[1-6]

石蜡包埋DNA样本修复试剂是针对FFPE样本而设计的修复试剂，可修复低质量FFPE样本不同程度的损伤，提高文库产量及测序质量。石蜡包埋DNA样本修复试剂可修复5 ng-1μg Fragmented FFPE DNA。世界上绝大多数的组织样品是使用福尔马林固定或石蜡包埋(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE)的方法处理的。要想提取出其中的核酸信息，相当有难度，因为FFPE样品中的DNA和RNA已经部分降解了，且DNA往往与组蛋白紧密交联。从福尔马林货石蜡包埋组织中提取核酸，是病理、法医等学科从分子水平上进行研究的基础。

根据不同的石蜡包埋方式，有两种提取方法：FFPE DNA Kit/石蜡包埋组织DNA提取试剂盒与GBCquick FFPE DNA Kit/石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒，现就各自的特点介绍如下：

FFPE DNA Kit/石蜡包埋组织DNA提取试剂盒采用传统的二甲苯的脱蜡方式来操作的，预先脱蜡后按组织DNA提取方法进行后续操作，主要包括SDS/蛋白酶K的消化蛋白，之后再加入胍盐与无水乙醇后过柱特定吸附核酸，经简单的洗涤之后，洗脱出高质量的DNA。该方法的优点是经典可靠，为许多公司的试剂盒采用，；本方法的缺点是要接触有毒的二甲苯，而且在二甲苯预处理的过程中可能会把一些潜在的病毒、细菌等除去，如果要获得病原菌的核酸信息可能不是最理想的纯化方式。

GBCquick FFPE DNA Kit采用的独特的脱蜡剂，操作过程中无需预先脱蜡，把脱蜡与组织的消化裂解结合在一起，这样既简化了操作的步骤，也能把潜在的病毒、细菌等病原微生物的核酸完全纯化下来。而且，采用的独特脱蜡剂是无毒无臭的，作为最新的操作方式而逐渐为广大用户采用。

不论是FFPE DNA Kit还是GBCquick FFPE DNA Kit操作的重点在于在过柱吸附之前组织必须要完全溶解，如果组织还没有完全溶解的话，就要继续消化。最后结果应该是表面光滑的半透明溶液，看不到任何微粒。孵育时间也取决于组织。例如，低密度组织(肺)所需的孵育时间就比高密度组织(心脏)少。有些样品、甚至连续消化3-5天才能获得比较高的产量。

在临床和分子生物学研究中，新鲜组织样本往往难以获得，甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)是目前最常用的人类病历档案标本。石蜡包埋组织被广泛应用于疾病诊断、法医鉴定、科学研究等方面。但是，在福尔马林固定和石蜡包埋时，由于受到多种因素和条件的影响，不可避免的造成DNA降解和交联，为从FFPET中提取高质量基因组DNA带来了困难。

应用^[7][8]

石蜡包埋DNA样本修复试剂可用于石蜡包埋DNA的样本修复：

福尔马林固定、石蜡包埋组织中提取DNA的方法。

方法：①根据石蜡切片厚度(2.5μm、5.0μm、10.0μm)、组织切片脱蜡时间(切片脱蜡2次,时间分别为2小时、2小时和2小时、12小时)、消化液中蛋白酶K浓度(125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml)、组织消化时间(4小时、8小时、12小时、24小时)等参数的不同,排列组合出96种不同条件,分别用于提取DNA。②石蜡组织连续切片,切片在二甲苯恒温水浴中振荡脱蜡后无水乙醇漂洗,真空干燥,加入细胞裂解液(自制),恒温水浴中振荡消化组织,苯酚/氯仿/异戊醇反复抽提,醋酸钠沉淀DNA,离心去上清,保存DNA备用。③不同方法提取的DNA量的检验:稀释200倍的DNA溶液用分光光度计在260nm和280nm分别读出光密度值,即OD260值和OD280值,DNA含量为:OD260值×10(μg/μl)。④不同方法提取的DNA质的检验:所有标本的OD260/OD280值均应该在1.6-1.8范围内,说明DNA中无蛋白、RNA和苯酚污染。

PCR反应扩增所提取的DNA中RET基因第11外显子,10μl PCR产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳,初步判断提取的DNA是否可以用于PCR反应;从琼脂糖凝胶中纯化目的基因DNA后再次以分光光度计测量纯化后的DNA含量,比较提取的DNA经PCR扩增后目的基因的产量;纯化后的PCR产物经荧光标记后自动测序仪测定目的基因碱基序列,观察提取的DNA是否可以用于直接序列测定。

结果所有标本提取的DNA之OD260/OD280值均在1.6-1.8范围内。各种石蜡切片厚度均可以提取一定数量的DNA,三组石蜡切片厚度之间比较无明显差异。但2.5μm组提取的DNA用于PCR扩增时效果远不如其它2组,即使PCR扩增后PCR产物电泳虽可见目的基因条带,条带也较淡,目的基因测序图混乱,难以读出碱基序列;2次脱蜡时间为2、2小时组脱蜡效果不如2次脱蜡时间为2、12小时组。

;随着蛋白酶K浓度的增加,提取的DNA数量也增加,最后行DNA测序时蛋白酶K浓度为500μg/ml和1000μg/ml组均可以得到满意的DNA测序图;组织消化8小时、12小时和24小时得到的DNA均适用于序列测定,但8小时组提取的DNA经PCR扩增后产物较12小时和24小时组少,12小时组与24小时组间比较无明显差别。目的基因DNA含量大于16ng/μl的标本测序时测序图较好,否则不适合于测序。

参考文献

[1]Detection of immunoglobulin gene rearrangement of B cell non-Hodgkin’s lymphomas and leukemias in fresh,unfixed and formalin-fixed,paraffin-embedded tissue by polymerase chain reaction.Inghirami G,Szabolcs MJ,Yee HT,et al.Laboratory Investigation.1993

[2]DNA amplification by polymerase chain reaction from brain tissues embedded in paraffin.Gall K,Pavelic J,Jadro-Santel D,et al.International Journal of Experimental Pathology.1993

[3]DNA amplification by polymerase chain reaction from brain tissues embedded in paraffin.Gall K,Pavelic J,Jadro-Santel D,et al.International Journal of Experimental Pathology.1993

[4]Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by the polymerase chain reaction.Jackson DP,Lewis FA,Taylor GR,et al.Journal of Clinical Pathology.1990

[5]Prognostic significance of p53 and ras gene abnormalities in lung adenocarcinoma patients with stage I disease after curative resection.Isobe T,Hiyama K,Yoshida Y,et al.Japanese Journal of Cancer Research.1994

[6]Extraction of DNA from paraffin-embedded tissue for analysis by polymerase chain reaction:new tricks from an old friend.Shibata D.Human Pathology.1994

[7]Analysis of DNA in fresh and fixed tissue by the polymerase chain reaction.Rogers BB,Alpert LC,Hine EA,et al.American Journal of Pathology.1990

[8]奇铁男.福尔马林固定、石蜡包埋组织中提取DNA的实验研究[D].吉林大学,2007.