荧光素二乙酸盐的合成及其稳定性

荧光素二乙酸盐又称二乙酸荧光素、荧光素二乙酸酯等，通常为淡黄色结晶性粉末。荧光素二乙酸盐可用于区分活细胞和死细胞，也可用于细胞活力、细胞毒性等检测。可作为酯酶、酰基酶、酰胺酶等多种酶的底物，通过检测荧光强度的变化来测定酶的活性。还可用于 LED 器件、石油标记、癌细胞识别、细菌和病毒检测、神经元线粒体功能研究等领域。

合成方法

取间苯二酚22.6g及邻苯二甲酸酐15g于三颈烧瓶中，并置于110℃的油浴锅中,在电动搅拌器的搅拌下熔融。完全熔融，加入11g氯化锌，在130℃下反应30 min后逐渐升温，150℃ 3.5h固化，放置自然冷却后，加入100ml 0.6moI/L HCI加热回流1h,趁热过滤，再用热HCl、热水、无水乙醇依次洗涤过滤，然后35℃烘干。将粗品置于三口烧瓶中，加入74ml 98.5%乙酸酐置于油浴锅中,设置温度80℃,加入1滴管吡啶在100℃下回流30min后,将温度升至120℃继续回流4h,取样至溶液检测(365nm)无荧光或荧光很弱,过夜搅拌冷却,得到双乙酰荧光素。

将冷却后的溶液减压过滤，加入70ml甲醇搅拌溶解后,再加入20%的氢氧化钠溶液皂化，冷却后,将36%乙酸在冰水浴中迅速加入，并快速搅拌,抽滤后烘干得到荧光素产品17g。取荧光素6.3g(约0.02mol),加入16ml乙酸酐(约为理论量的5倍),在90℃的油浴锅中搅拌混合均匀，然后逐渐将温度升至120℃反应7h，自然冷却至室温,过滤、烘干,得到荧光素二乙酸盐的粗品6.7g。将粗品溶于四氢呋喃重结晶，过滤烘干后得到6.5g淡黄色纯荧光素二乙酸盐晶体粉末，产率为78.12%[1]。

稳定性^[1]

1、浓度的影响

溶液浓度分别为0.1x10^-3g/L、0.5x10^-3g/L、10^-3g/L、1.5x10^-3g/L、2x10^-3g/L,同一条件下,检测各溶液的水解随时间荧光强度的变化。

结果荧光素二乙酸盐的浓度低于0.5x10^-3g/L时，溶液水解后的荧光发光强度与浓度呈线性关系，而大于1.5x10^-3g/L时，水解后的荧光强度随浓度增加其荧光强度逐渐增强。在10^-3g/L~1.5x10^-3g/L间，FDA的水解相对缓慢，说明浓度在10^-3g/L~1.5x10^-3g/L之间，荧光素二乙酸盐的性质比较稳定。

2、温度的影响

取原液0.5ml分别加入5个烧杯中，然后加入pH为7的缓冲液50ml配成1:100的待测液，搅拌，分别置于温度为0℃、12℃、25℃、37℃、50℃的水浴锅中。同一条件下,测定各溶液的荧光强度。

结果可知，荧光素二乙酸盐水解后溶液的发光强度随温度的升高而升高，说明荧光素二乙酸盐在低温条件下比较稳定。

3、pH的影响

取原液0.5ml分别加入5个烧杯中，然后分别向每个烧杯中加入50ml pH为5、6、7、8、9、10的缓冲溶液，搅匀后，放置于温度为37℃的水浴锅中，一段时间后，观察颜色变化，并检测各溶液的荧光强度，

结果荧光素二乙酸盐在碱中和酸中均发生了水解反应。实验结果表明，pH在5~8的溶液中是比较稳定的。

参考文献

[1]王启华. 荧光素二乙酸酯的合成及其稳定性分析[J]. 硅谷,2013(11):169-169,127. DOI:10.3969/j.issn.1671-7597.2013.11.178.