人细胞凋亡PCR芯片

背景^[1-6]

人细胞凋亡PCR芯片可用于研究参与细胞程序性死亡的84个关键基因的表达。细胞凋亡在正常生物过程中发挥重要作用，如分化、发育和体内平衡。应激反应，如热休克、缺血、非折叠蛋白和病毒感染，会引起细胞严重受损甚至细胞凋亡。细胞凋亡经常导致不可控的细胞生长，如肿瘤形成和癌症；同时肿瘤坏死因子（TNF）受体也会通过激活FADD和其他死亡受体蛋白引起凋亡。

这一芯片包含了TNF配体及受体、bcl-2、半胱天冬酶、IAP、TRAF、CARD、死亡域、死亡效应域、CIDE家族，以及参与p53和DNA损伤通路的基因。研究这些基因的表达有助于确定在生物模型和细胞模型中的细胞机制。通过实时定量PCR的方法，研究者即能够利用该芯片简单可靠地同时检测细胞凋亡相关基因的表达。

实时定量PCR是检测基因表达最灵敏、最可靠的方法，但只能检测少数几个基因的表达水平。若要检测大量基因，则工作量巨大，耗时长久。PCR芯片，克服了这一缺点，可同时进行多种基因检测，还可以节省数据分析时间，使研究者可以在更短的时间内得到更丰富的信息。PCR芯片可广泛用于生命科学、生物技术、疾病检测、临床医学和环境检测等领域，是近年生命科学领域常用的研究手段之一。

随着研究的的段进展，需要研究的基因也在不断地更新换代，找到一张适合自己的PCR芯片，也就成为了实验成功的关键。细胞凋亡PCR芯片有96孔和384孔两种规格，可以同时对几十到几百个与某一主题相关的基因进行分析。

产品采用SYBR Green实时荧光PCR方法。以96孔PCR芯片为例，基因专一性引物已分别固定在96孔PCR芯片中。只需要将反转录反应产生的cDNA与PCR master mix混合，再将混合物分配到PCR板的96个孔位，进行实时荧光PCR反应，就能轻松获得91个相关基因的表达情况。应用2块96孔PCR芯片分别对实验样品和对照样品进行分析，就能对91个基因的表达进行相对定量。每一块96孔PCR芯片设有4个看家基因对照（β-actin,GAPDH,18S,28S），以方便在实验下选择稳定表达的参比基因，用于基因表达相对定量。每块PCR芯片还设有一个PCR阳性对照（Positive Control）。PCR阳性对照用于质控PCR反应。

PCR芯片的优点：

简单快捷：可同时检测几十到几百个基因；

灵敏度高：样本要求低，总RNA最少可为0.5ng；

重复性高：Ct值的平均差异只有1个循环；

数据全面、可靠：芯片包含的基因来自公共权威数据库、权威综述和相关文献挖掘；

PCR芯片主要实验流程

1.样品RNA抽提

2.DNase I消化RNA样品

3.RNA纯化

4.RNA质量检测

5.cDNA合成

6.实时定量PCR

按照芯片说明将cDNA模板适当稀释后加入到实时定量PCR反应混合液中，然后在含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液，进行实时定量PCR反应。

7.数据分析

利用配套软件计算PCR芯片中的各个基因的Ct值，采用公认的ΔΔCt方法比较基因的表达变化。

应用^[7][8]

人细胞凋亡PCR芯片可用于细胞凋亡信号通路研究：

肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)通过TLR2-MyD88-NF-κB信号途径诱导B细胞成为分泌高水平IL-10的调节性B细胞(IL-10~+Breg细胞),并依赖IL-10抑制T细胞的活化及其抗肿瘤作用;同时发现:TRAP能通过TLR4-MyD88-p38信号通路诱导单核/巨噬细胞成为高表达PD-L1和IL-10的M2样巨噬细胞,并通过PD-L1/PD-1和IL-10抑制T细胞的活化及其抗肿瘤作用。

但是,TRAP是否能够调节中性粒细胞功能并在肿瘤免疫中发挥相应的免疫调节作用,有待进一步研究。目的:探讨肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)是否调节中性粒细胞的细胞生物学行为,研究TRAP诱导中性粒细胞凋亡的分子机制,初步探讨吞噬TRAP的中性粒细胞是否对T细胞和肿瘤细胞具有调节作用及其机制。

肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)调节中性粒细胞的细胞生物学行为的研究中性粒细胞能够快速大量地吞噬TRAP,TRAP可诱导中性粒细胞凋亡。与DNase I和RNase A处理的TRAP相比,Proteinase K处理的TRAP诱导中性粒细胞凋亡的比例明显减少。与膜结构完整的TRAP相比,膜破碎的TRAP不能诱导中性粒细胞凋亡。

参考文献

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[8]高蓉.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）诱导中性粒细胞凋亡及其生物学功能的机制研究[D].东南大学,2018.