鲎试剂的应用

背景及概述^[1][2]

鲎试剂是从海生动物赏提取的鲎细胞溶解物,是检测革兰氏阴性细菌内毒素的一种敏感试剂。鲎试验(Limulustest)可作为革兰氏阴性细菌败血症、脑膜炎和尿路感染等的一种快速、敏感的诊断方法,并可应用于注射药品及生物制品的热原质检测,卫生学上可用来检查各种水质和食品污染的程度。

理化性质^[1]

1968年LevinJ和BangFB创建鲎试剂以来,使内毒素的检测成为灵敏、快速、简便的方法,已被举世公认,并被美、日、中、欧洲药典以《细菌内毒素试验》收载,但是由于上述非特异性的存在,使这一试验的实际应用受到一定限制。为了克服这一弊端,各国学者进行了深入研究。由于上述鲎试验反应机理已被阐明,设法阻止右侧旁路反应,便能使鲎试剂对内毒素的检测达到特异性的目的。

日本最先推出的鲎试剂其商品名为En-dospecy其生产工艺的特点是将普通鲎试剂中存在的G因子,以亲和层析方法分离去除。国内有人称无(弃;去)G因子鲎试剂。显然,鲎试剂中没有G因子,即使被测样品中存在真菌多糖(非内毒素),也不能产生活化的G因子,在反应旁路系统中就不能激活凝固酶原,旁路反应被阻断,使成为对内毒素具有特异性。

国内吴伟洪等报道,以同样方法制备了仅含C、B因子的鲎试剂。但是以这种工艺制备的特异鲎试剂,由于在分离G因子的过程中,必需防止带入微量内毒素,即所用分离试剂、柱床、器皿及操作过程,严防内毒素污染,不仅增加了制备工艺的难度,也必然增加鲎试剂的成本,因此很难推广应用。

1989年BerzofstyRN报道,在制备普通鲎试剂时,为了提高检测内毒素的灵敏度,均采用氯仿提取存在于鲎试剂粗制品中的抗LPS(脂多糖)因子。氯仿提取的结果确实增加了鲎试剂的灵敏度,但同时将存在于鲎试剂粗制品中的抗G因子一同除去,这就使普通鲎试剂易被真菌多糖激活,增加了普通鲎试剂的非特异性。因此提出不用氯仿提取,改用一种特殊(专利)试剂,只除去抗LPS因子,而保留抗G因子,以达到即增加了对内毒素的敏感性,又削弱了真菌多糖活性G因子的能力。

这是从鲎试剂的生产工艺上进行改革,实现提供商品特异鲎试剂的一种方法。1990年TsuchiyaM报道,由于真菌多糖与普通鲎试剂反应形成凝胶,有一个特定浓度范围(10-3～10-6mg/mL),大于或小于这个浓度都不能成胶,故在制备普通鲎试剂的基础上,加入过量的真菌多糖(1mg/mL),可阻止G因子的活化,即“封闭”了旁路,达到制备鲎试剂的目的。显然采用这一措施制备特异鲎试剂,较以上两种方法既简便又经济,可使特异鲎试剂商品化。

鲎

应用^[3]

由于鲎试剂对细菌内毒素的特导性反应,所以它不仅用于药品的热原检查,而且也可用于临床和化验室的疾病诊断及卫生学上。细菌内毒素是革兰氏性菌所产生的一种毒素,通过检查细菌内毒素可以判断是革兰氏阴性菌或是阳性菌感染,有文献报认为利用LAL微量凝固法具有很好的敏感性和特异性,对诊断革兰氏阴性菌脑膜炎很有使用价值,方法简单易行且价格便宜。

另外LAL试验法对发烧患者内毒素血症的早期预测有重要作用。其确定诊断要靠血培养作细菌学检查证明血样中有革兰氏阴性菌存在。这种检查往往需要花费几天的时间,很多实验资料证明,革兰氏阴性菌败血症的许多症状是由内毒素血症造成的。因此有人开发一个快速敏感的显色性鲎试验法并用测定期内毒素的含量来预测发烧患者的败血症。另外,还可用于心脏手术时遇到的循环内毒素的监测。

以确诊心脏手术后发烧的原因,可作为腹腔透析的腹膜炎患者革兰氏阴性菌感染的快速敏感诊断法。其他还曾报导的有:血中内毒素含量的测定、发烧患者内毒素血症的早期预测、尿中内毒素检测、各型肝病的内毒素监测、水或食品中内毒素含量的检测等等。但是所有以上用于临床上的研究和报导都还处于研究阶段,真正要在临床和检验上普及,还需要解决许多技术上和方法学上的难题。

目前,主要用药品热原检查的凝胶法,只是一种限量检测,要真正在临床上普及使用定量的方法,还得解决许多技术上的难题,另外,鲎试验是一种内毒素检测,不能检测到病源菌,这也是在临床应用中一个缺限。因此,近几年,鲎试验的研究也主要集中在药品的内毒素监测上。值得注意的是,虽然鲎试验作为一种检测手段,经济、快速、简单、易行、灵敏又准确。

但是由于我国在此方面研究基础比较薄弱,在鲎试剂的质量,灵敏度,稳定性,各支的均一性;内毒素各种标准品、鲎试剂对照品等方面都有其不足的地方。与国际同类品种有很大的差距。近年来,随着鲎试验反应动力学理论的阐明和随之而建立的内毒素定量分析技术的发展,为扩大鲎试验在药品质控领域提供了理论基础和研究手段。

制备^[2]

1、将新鲜活鲎洗净，用75％的乙醇消毒，心门采血，加入抗凝剂，在10～15℃制得鲎血；

2、在750～800转/分的速度下将鲎血离心分离，弃蓝色血清，将余下的白色细胞按体积比1∶4加入助悬洗涤剂，处理后，加入细胞破解剂，剧摇至血细胞完全破解，在0℃下存放获得细胞内溶物；

3、加入体积比为1∶0.8～0.6的CHCl3，在2～5℃下剧摇，在2500转/分～3000转/分的速度下离心分离，收集细胞内溶物即鲎试剂原液，加入增敏剂，预检，再加至敏保护剂，分装，在零下45℃～55℃冻干，即得鲎试剂成品。

主要参考资料

[1] 夏振民, & 刘大英. (1997). 特异鲎试剂研究进展. 药物分析杂志(5), 353-355.

[2] 周海钧. (1988). 热原的本质及鲎试剂的进展. 中国药学杂志, 23(5), 275-278.

[3] 王莉, 高华, 蔡彤, 张国来, & 季晖. (2007). 鲎试剂的研究及应用进展. 药物分析杂志(6), 938-942.