青霉素-链酶素溶液的应用

背景及概述^[1][2]

青霉素-链霉素溶液，溶于0.85%NaCl溶液，含青霉素10000单位，链霉素10000μg/ml。

应用举例^[2]

用于培养人表皮干细胞：

(1)将取下的人包皮组织用0.5%碘伏浸泡一分钟，PBS彻底漂洗两次至肉眼观察不再有碘伏着色。包皮组织来自第三军医大学西南医院泌尿外科12～20岁行包皮环切术无泌尿系 感染等疾病患者(患者知情同意)；

(2)无菌条件下尽量修剪掉皮下脂肪组织，组织修剪为约0.5cm×1cm大小的皮片。

(3)加入0.25%的中性蛋白酶Ⅱ溶液充分覆盖组织块，4℃消化l2～16h；0.25%的中 性蛋白酶Ⅱ的配置及使用方法为，0.5gDispaseII(Roche)溶入100mL0.1MPBS，4℃、过夜， 再搅拌促溶解0.22um过滤，分装10ml/瓶，-20℃，保存；

(4)吸弃中性蛋白酶Ⅱ溶液，PBS清洗后用眼科镊轻轻牵扯组织，分离表皮与真皮；分 离表皮与真皮层时需特别注意保护表皮完整性，尽量避免真皮成分脱落（否则可致成纤维细胞污染）；

(5)收集并剪碎表皮组织，加入0.25%胰蛋白酶溶液于37℃消化10min；

(6)加入含10%小牛血清RPMI164010mL终止消化后，吹打成混悬液，200目筛网研 磨过滤;

(7)1000rpm/min条件下离心5min以收集细胞；

(8)弃去上清液后，PBS洗涤一次；

(9)加入K-SFM并轻柔吹打制成2.5×10⁵/mL单细胞悬液，接种4mL单细胞悬液于预 先包被了IV型胶原的25cm2培养瓶中，37℃静置10min；无血清角质细胞专用培养基 K-SFM配置方法为，K-SFM(Invitrogen10725)：加入rEGF：(0.1～0.2)ng/mL，BPE:(20～30) μg/mL；加入CaCl₂0.05mM；双抗（青酶素-链酶素溶液）100U/mL；IV型胶原包被培养瓶或培养板的方法为，按照10μg/cm2计算，将适量0.lmg/mL的IV型胶原溶液加入细胞培养 瓶或培养板中，保证液面能够充分覆盖培养瓶或培养板底部即可；放置4℃冰箱，过夜（约 12小时）或更长时间。使用前应用PBS液清洗IV型胶原包被了的培养瓶或培养板；

(10)吸去上层细胞悬液，用PBS轻轻漂洗两次，加入适量4mLK-SFM；

(11)37℃、5%CO₂孵箱培养(常规培养)；

(12)次日更换细胞培养液，继续常规培养，每2天换液1次。

(13)待细胞生长密度为70～80%时，进行细胞传代，包括如下步骤：

a、吸弃原细胞培养基，PBS洗2次；

b、加入0.25%胰酶1～1.5mL，37℃、5%CO2孵箱孵育6～10分钟（镜下观察大部分细胞脱落时终止消化）；

c、加入含10%小牛血清RPMI164010mL终止消化后，吹打成单细胞混悬液；

d、移入离心管中，1000rpm/min条件下离心5min以收集细胞；

e、按1︰5传，加入K-SFM培养液；常规培养，共传代8次。

本发明方法具有快速、高效、方法简便、细胞活性高、细胞干性 强等特点。采用本发明方法培养人表皮干细胞至少能传到8代，极大提高了细胞扩增倍数； 且分化控制好、细胞成分单一，因而具备了应用到临床上的基本条件。

主要参考资料

[1] 青霉素-链霉素溶液（100×）说明书

[2] CN201410112277.3 人表皮干细胞的分离与培养方法