0.05%胰酶溶液(不含EDTA)

背景及概述^[1][2]

用于细胞培养。保存条件： -20°C，一年有效。产品不含酚红，0.5g/L 胰酶（1：250）溶于 HBSS 溶液，不含钙镁。

制备^[2]

0.05% 胰酶溶液：称取0.1g 胰酶，加入200 mL PBS 冰水浴搅拌30 min，0.22 μm的微孔滤器除菌，分装，-20℃保存；

应用 ^[3]

针对目前一些采用哺乳动物细胞来测试卷烟烟气总粒相物遗传毒性的方法不够简便等特点，按照遗传毒理学检测应着重来源于人体组织细胞的原则，而专门开发的一种采用人支气管上皮细胞系（BEAS-2B细胞）来进行卷烟烟气遗传毒性测试的方法，本方法省略了添加代谢活化体系的处理过程，可以较好的反映卷烟烟气的体外遗传毒性，操作简单，灵敏度高，针对性强，结果可靠。

通过以下技术方案来实现的：一种采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法，包括以下步骤：先在培养好的BEAS-2B细胞中加入卷烟烟气总粒相物（TPM）的提取物样品进行暴露，暴露过的细胞经培养和冷甲醇固定，然后用DAPI溶液荧光染色，选择分布均匀、染色较好的区域，在荧光显微镜下拍照计数，每个样品计数1000个双核细胞中含微核的细胞数量，与不加卷烟烟气总粒相物暴露的对照样品比较，判断卷烟烟气引起细胞微核增加的数量，进而判断卷烟烟气的遗传毒性的大小；具体步骤如下：

a. 细胞培养及接种：将BEAS-2B细胞接种于细胞培养液中并置于CO₂培养箱孵育，当细胞生长达到70%-80%汇合时采用0.05% 胰酶溶液消化细胞并制备细胞悬浮液，将制备好的细胞悬浮液计数后接种至直径35mm培养皿中，使每皿的细胞数量为1.5×10⁵-2.0×10⁵个，添加培养液至总体积为2mL，于CO₂培养箱中继续培养24h；

b. 卷烟烟气总粒相物暴露：按照国标的方法通过吸烟机抽吸卷烟，并制备TPM的二甲基亚砜（DMSO）提取物样品，去除培养皿中的培养液，设四类实验组：细胞对照组、溶剂对照组、阳性对照组和TPM组，各组内每个检测剂量均设3个平行皿；TPM组根据细胞半数致死剂量IC50，取1/2 IC50、1/4 IC50、1/8I C50和1/16 IC50 4个剂量，分别加入不同剂量的TPM样品，并用DMSO补齐各TPM浓度组使得组内培养皿中DMSO的浓度一致；细胞对照组只加细胞培养液；溶剂对照组加入DMSO，加入的DMSO量与TPM组1/2 IC50剂量的体积数一致；阳性对照组加2 μL环磷酰胺溶液；各组加入受试物后，同时每皿内加入12 μL细胞松弛素B溶液，最后用细胞培养液将每皿内溶液体积补足至2 mL，继续在CO₂培养箱中培养24 h；

c. 微核测试：移除培养皿内的溶液，用PBS溶液漂洗2遍，弃掉洗液后，用约2 mL甲醇溶液固定10 min，倒置晾干，向培养皿中加入1 μg/mL的DAPI 1.5 mL避光染色10 min，用蒸馏水冲洗3次，黑暗处自然晾干或风干；在荧光显微镜下紫外激发进行观察，选择分布均匀，染色良好的区域，进行拍照及图像计数，每个样品计数1000个双核细胞中含微核的数量；选择观察的双核细胞核质应相互分开，微核不与主核重叠，易于分辨；

d. 数据处理和分析：将TPM组与溶剂对照组相比，统计分析微核率是否有剂量反应关系并有统计学差异，评价卷烟烟气的遗传毒性。

主要参考资料

[1] 0.05%胰酶溶液(不含EDTA)说明书

[2] CN201310013300.9 一种卷烟烟气总粒相物生物学评价的MTT细胞毒性试验方法

[3] CN201410059881.4 采用双核法检测卷烟主流烟气总粒相物遗传毒性的方法