小鼠主动脉平滑肌细胞的培养

背景及概述^[1-2]

平滑肌细胞又叫平滑肌纤维，系构成平滑肌的纤维状长细胞。由于平滑肌所分布的部位不同，平滑肌细胞的长度很不一致，在小血管壁上的平滑肌细胞长度仅有20μm左右，妊娠期子宫壁平滑肌细胞可长达500μm，位于一般器官平滑肌细胞的长度约200μm左右，此细胞的宽度在7μm以内。

平滑肌细胞多聚集成束，细胞轮廓不清，需用适当浓度的酸(碱)溶液将其分离，方可获得外形完整的肌细胞。细胞内只有1个细胞核，呈椭圆形或长杆状，位于细胞中段最宽的部分，长度与纵轴平行，核染色质为纤细网状，可见2个以上核仁。在制作切片标本时，如肌细胞收缩则可变粗，核也随之变粗，甚至可出现螺旋形的扭曲。

小鼠主动脉平滑肌细胞分离自主动脉组织；小鼠主动脉平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。

传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。小鼠主动脉平滑肌细胞在心血管疾病发生、发展中具有重要作用，以小鼠主动脉平滑肌细胞为实验研究对象，探讨心血管疾病相关发病机制是目前研究的热点；体外培养的主动脉平滑肌细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

小鼠主动脉平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经alpha-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

分离培养^[2]

1）取材：颈椎脱臼处死小鼠，在75%乙醇中浸泡2min，用眼科剪镊依次打开胸、腹腔，暴露心脏；10mL注射器抽取无菌PBS约10mL，连接在1mL注射器针头上穿刺左心室，冲洗主动脉。完整分离主动脉，放入35mm平皿中，加入2mL PBS缓冲液。在体视显微镜下小心将血管周围的结缔组织去除，使用显微弹簧剪沿主动脉纵轴剪开动脉，用显微镊子小心分离动脉中膜层并移入另一个含有2mL含20%FBS的DMFM/F12培养液的35mm平皿中，迅速转移至超净台。用眼科剪将中膜剪成大小约1mm×1mm的组织块，备用。

2）组织块培养法：将组织块连同培养液一起移入6孔板中，小心吸出培养液，摇晃6孔板，使组织块分散分布于6孔板底，将细胞移入5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中孵育6h，使组织块牢固贴附于培养孔底部后缓慢加入2mL含20%FBS的DMEM/F12培养液。放入5%CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养，每3d换液一次，组织块周围爬出的细胞达到培养面积80%时（18~20d）进行传代。

3）胶原酶消化法：将剪碎的组织块移入到15mL离心管中，加入3mL消化液（7.5mgII型胶原酶溶于5mL含20%FBSDMEM/F12中），放入培养箱中消化6h，1200r/min离心5min，去掉上清，加入2mL含20%FBSDMEM/F12培养基，轻轻吹打分散细胞，接种于6孔板中，置于5%CO2，37℃饱和湿度培养箱内培养，当细胞生长至80%汇合度（7~10d）即可传代。

4）细胞的生长及传代：吸取并弃掉旧培养基，加入PBS磷酸缓冲液清洗细胞充分洗去残留的血清成分；6孔板每孔加入0.25%胰蛋白酶500μL，在37℃消化3min；倒置显微镜下观察到细胞收缩变圆时，立即加入含FBS的培养基终止消化，将细胞从培养板底冲洗下来，以1：3的比例传代至新的6孔板中。每2d换液1次，待细胞生长达到70%以上汇合度时再次传代。

5）小鼠主动脉平滑肌细胞鉴定：分别对2种方法分离的3代和8代细胞进行免疫荧光鉴定。待细胞处于指数生长期时，弃培养基，加入PBS缓冲液清洗3次，每孔加入1mL4%多聚甲醛，室温固定20min；PBS洗3次，加入0.25%TritonX-100室温透膜1h；PBS洗3次，加入含10%山羊血清PBS的封闭液室温封闭1h；PBS洗3次，加入羊抗鼠α-SMA一抗（1：200稀释），4℃孵育过夜；PBS洗5min×3次；加入Alex488兔抗羊二抗（1：1000稀释）4℃孵育过夜；避光下PBS洗5min×3次；加入DAPI染核，室温避光10min，PBS洗5min×3次；在倒置荧光显微镜下观察。

6）结果：采用组织块培养法的细胞8d左右可见细胞从组织块周围爬出，培养12d左右组织块周围细胞明显增多，细胞中可见1个或数个核仁，细胞主要为长梭状、带状或三角状，部分细胞有突起胞核位于细胞中央（图1A）。培养18d左右细胞达到80%汇合度。采用胶原酶消化法分离的小鼠主动脉小鼠主动脉平滑肌细胞于24h后完全贴壁，胞质完全伸展，第4~7d细胞增殖速度加快（图1B），生长7d后细胞汇合度可达80%以上，细胞致密呈多层典型"峰-谷"结构出现。

相关研究^[3]

有实验探讨钙激活氯通道蛋白ANO1在C57BL/6小鼠主动脉平滑肌细胞中的表达及其功能特性。运用胶原酶消化法获得原代培养的小鼠主动脉平滑肌细胞，流式细胞术检测平滑肌细胞纯度；应用RT-PCR检测主动脉平滑肌细胞ANO1mRNA的表达；免疫印迹检测ANO1蛋白在主动脉平滑肌细胞的表达情况；应用荧光淬灭动力学实验检测ANO1钙激活氯通道的功能特性。

原代培养成功获得主动脉平滑肌细胞；RT-PCR结果分析表明，主动脉平滑肌细胞在mRNA水平有ANO1表达；免疫印迹显示主动脉平滑肌细胞蛋白水平有ANO1表达；荧光淬灭动力学实验证实表达在主动脉平滑肌细胞的ANO1具有阴离子转运功能，即钙激活氯通道典型特性。小鼠主动脉平滑肌细胞表达的ANO1是钙激活氯通道的分子基础。

主要参考资料

[1] 新编实用医学词典

[2] 小鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养及鉴定

[3] 钙激活氯通道蛋白ANO1在小鼠主动脉平滑肌细胞的表达及其功能鉴定