AAV-293/人胚肾细胞的应用研究

背景及概述^[1]

AAV-293/人胚肾细胞源自普遍使用的293[HEK-293]细胞株，但AAV-293细胞产生的病毒滴度更高。293[HEK-293]细胞是剪切过的腺病毒5型DNA转染的人胚肾细胞。跟293[HEK-293]细胞一样，AAV-293细胞反式表达腺病毒E1基因，当共转染三个AAV助质粒(一个含ITR的质粒、pAAV-RC和E1缺失助质粒)时，AAV-293/人胚肾细胞可以产生有感染力的腺病毒-相关病毒颗粒；因此使用AAV-293/人胚肾细胞株繁殖腺病毒相关重组病毒。AAV-293/人胚肾细胞生长培养基为MEM高糖(PM150210)＋10%FBS(164210-500)＋1%P/S(PB180120)，冻存条件为：使用50%基础培养基+40%胎牛血清+10%DMSO的冻存液；温度为液氮。

应用研究^[1]

AAV-293/人胚肾细胞可用于构建睫状神经营养因子(CNTF)基因和绿色荧光蛋白(GFP)共表达的腺相关病毒载体，获得高效的腺相关病毒转基因平台。方法是设计与合成CNTF蛋白编码区两端的引物，高保真酶扩增CNTF蛋白编码区序列。采用限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接等方法，将CNTF基因插入腺相关病毒载体pAAV-IRES-hrGFP中，构建CNTF和GFP共表达的腺相关病毒载体(pAAV-CNTF-IRES-hrGFP)。在脂质体介导下，与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共转染来源于AAV-293/人胚肾细胞，包装产生腺相关病毒(rAAV-CNTF)；收集病毒颗粒，感染体外培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)。荧光显微镜下观察GFP的表达。

结果显示：

1）pAAV-CNTF-IRES-hrGFP质粒通过PCR法和SalⅠ/BamHⅠ双酶切分析鉴定，结果表明插入目的DNA片段与预期结果一致，进一步DNA测序结果表明插入片段为CNTF目的基因，且其DNA序列和读码框正确。

2）三质粒共转染AAV-293/人胚肾细胞后，荧光显微镜下观察可见大量绿色荧光。提取病毒基因组经PCR证实病毒携带CNTF基因。

3）带有CNTF的重组腺相关病毒可有效感染体外培养的人RPE。结论：成功构建了pAAV-CNTF-IRES-hrGFP质粒，包装、制备了高滴度的rAAV-CNTF病毒。获得的重组病毒可有效感染RPE。

主要参考资料

[1] 睫状神经营养因子和绿色荧光蛋白共表达的重组腺相关病毒载体的构建