实时荧光定量PCR服务

背景^[1-6]

实时荧光定量PCR服务是当今生物学研究的重要手段之一。包括基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等在内的各领域的科学家们使用这种方法进行广泛的应用研究。实时荧光定量PCR的主要优点是能够准确地确定初始模板拷贝数，具有较宽的动态范围以及较高的灵敏度，满足定性和定量实验的需求。科学研究中较为常用的是SYBR Green qPCR和T aqMan探针qPCR。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。实时荧光定量PCR是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

服务内容：

①引物设计与合成；

②RNA抽提纯化；

③基因组DNA消化处理；

④RNA质量检测；

⑤cDNA合成；

⑥实时荧光定量PCR检测；

⑦提交实验数据和报告。

实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2.SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

3.分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光。

应用^[7][8]

实时荧光定量PCR服务可用于蛋白组学研究中的转录水平的验证服务：

在低温胁迫下拟南芥差异蛋白质组学研究中以模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,利用双向电泳、质谱技术并结合荧光定量PCR方法,对低温胁迫条件下的拟南芥进行了差异蛋白质组的比较分析,以探索植物的抗寒机制。实验中对蛋白质样品制备、上样方式、双向电泳参数的选择等技术环节进行了优化,建立了适合拟南芥蛋白质组学研究的技术平台。同时进行了蛋白质样品的分级制备研究,提高了低丰度蛋白的检测效果。

2-DE图谱分析结果表明,在低温胁迫条件下,共检测到67个蛋白丰度差异表达变化在2倍以上的蛋白点。对其中的57个蛋白点进行了MALDI-TOF-MS分析,有42个蛋白点得到了有效鉴定,包括9个已知的低温胁迫响应蛋白和在本实验中首次发现的一些低温应答蛋白。这些蛋白在代谢、能量、防御反应等方面发挥重要作用。应用实时荧光定量PCR技术检测了其中32个蛋白在转录水平上的变化,结果显示mRNA与蛋白质水平的变化并不完全一致。

参考文献

[1]Characterization of two Arabidopsis thaliana glutathione S-transferases[J].Eliana Nutricati,Antonio Miceli,Federica Blando,Luigi De Bellis.Plant Cell Reports.2006(9)

[2]Overexpression of Multiple Dehydrin Genes Enhances Tolerance to Freezing Stress in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology.2004(5)

[3]Depletion of the high-abundance plasma proteins[J].Amino Acids.2004(3)

[4]The Plant Dehydrins:Structure and Putative Functions[J].Ch.R.Allagulova,F.R.Gimalov,F.M.Shakirova,V.A.Vakhitov.Biochemistry(Moscow).2003(9)

[5]Identification of mitochondrial protein complexes inArabidopsis using two-dimensional blue-native polyacrylamide gel electrophoresis[J].Philippe Giege,Lee Sweetlove,Christopher Leaver.Plant Molecular Biology Reporter.2003(2)

[6]Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response[J].Jixin Dong,Chunhong Chen,Zhixiang Chen.Plant Molecular Biology.2003(1)

[7]The proteome of the chloroplast lumen of higher plants[J].Photosynthesis Research.2003(3)

[8]席景会.低温胁迫下拟南芥差异蛋白质组学研究[D].吉林大学,2007.