狗血清的应用

背景^[1-6]

狗血清采用健康狗血液为原料，经无菌采集、分离、微孔过滤后而成，性状为澄清液体，无噬菌体、低内毒素，无溶血无异物无细菌真菌支原体霉形体衣原体等，适用于试验室或生化科研相关试验，满足不同科研实验的多种需求。狗血源以封闭的穿刺方式采自动物，产品经3次100nm过滤，在净化车间过滤包装。经严格检测确保无支原体，细菌病毒检测依据美国药典（USP）和美国联邦法规第九篇（9CFR），符合国际检测标准。

狗血清和血浆的制备：

狗血清和狗血浆均是不含细胞（包括血小板）等有形成分的血液液体部分，其主要区别是血清不含凝血因子和血小板，血浆则含有凝血因子，它们的制备方法如下：

1.狗血清的制备：获得的血液不能抗凝，盛于离心管或可以离心的器皿中，静置或置37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心（一般为3000rpm，离心5～10min），得到的上清液即为血清，可小心将上清吸出（注意切勿吸出细胞成分），分装备用。

2. 狗血浆制备：在盛血的容器中先加人一定比例的抗凝剂（抗凝剂：血液=1：9，将血液加到一定量后颠倒混匀，离心（离心条件同上）后所得的上清液即为血浆。初用者将上清移至另一清洁容器，吸出血浆时用毛细吸管贴着液面逐渐往下吸，切忌不能吸起细胞成分。

狗血清和狗血浆的主要区别：

1，血浆是离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，其中含有纤维蛋白原（纤维蛋白原能转换成纤维蛋白，具有凝血作用），若向血浆中加入钙离子，血浆会发生再凝固，因此血浆中不含游离的钙离子。

2，血清是离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体，其中已无纤维蛋白原，但含有游离的钙离子，若向其中再加入钙离子，血清也不会再凝固。

3， 血浆与血清的另一个区别是：血清中少了很多的凝血因子，以及多了很多的凝血产物。另外，血清中含有特异性免疫抗体（如抗毒素或凝集素）的免疫血清（抗菌素血清）。简单说血浆里含有血清和血细胞

狗血清（无菌过滤），注意事项：有少量蛋白质结块析出不影响使用。未融化或融化未经摇匀的血清禁止直接放入高温水浴内加温。减少血清重复冻融。血清在室温或4℃冰箱内放置过久会影响促细胞生长效果。

狗血清的解冻：

将血清从冰冻区中取出后（切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀），先置于2～8℃区域中使之融化，然后在室温下使之全融。使用前再预温到将使用的温度（如37℃），但必须注意的是，解冻过程中应轻轻地摇晃均匀。血清在解冻过程中可能会出现少量絮状或片状析出物，主要是血清中脂蛋白的变性或是纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）析出，但这些析出物，并不影响血清本身的质量。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

应用^[7][8]

狗血清可用于ELISA抗体检测实验：

钩端螺旋体外膜蛋白血清学诊断价值和CTB-OmpL1疫苗免疫保护作用评价实验中为提高血清学检测的敏感性和特异性，克隆、表达LipL21,Loa22,LipL32和LigACon4-8，并以这4种重组蛋白为抗原，建立检测马和狗血清中相应抗体的ELISA和狗血清中相应抗体的LUMINEX法，为研制诊断钩体病的新血清学检测方法奠定实验基础。

应用分子生物学方法，构建CTB-OmpL1重组乳酸菌口服疫苗，并利用仓鼠模型评价其免疫保护作用，为研制新型疫苗奠定基础。研究内容与方法：

1.采用PCR方法，从钩端螺旋体基因组DNA中分别扩增LipL21,Loa22,LipL32和LigACon4-8基因片段，构建原核表达载体LipL21-PET28/Rosetta,Loa22-PET28/Rosetta,LipL32-PGEX4T2/BL21，LigACon4-8–PET28/Rosetta，大量诱导表达重组菌，运用Ni+NTA及正负离子吸咐柱纯化获得重组蛋白,用Wester blot鉴定。

2.以重组蛋白LipL21,Loa22,LipL32和LigACon4-8为抗原，建立检测马血清和狗血清中相应抗体的ELISA，用建立的ELISA检测大量临床马血清和狗血清并与传统MAT比较，评价其诊断价值。

3.以重组蛋白LipL21,Loa22,LipL32和LigACon4-8为抗原，建立检测狗血清中相应抗体的Luminex法,检测大量临床狗血清中相应抗体,并与传统MAT比较，评价其诊断价值。

4.用基因工程技术，克隆、表达钩端螺旋体重组蛋白CTB-OmpL1，转入乳酸菌中制备CTB-OmpL1口服疫苗；制备仓鼠钩体感染动物模型，通过该模型评价该口服疫苗的免疫保护作用。

参考文献

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[2]Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using a Recombinant LigA Fragment Comprising Repeat Domains 4 to 7.5 as an Antigen for Diagnosis of Equine Leptospirosis[J].Weiwei Yan,Muhammad Hassan Saleem,Patrick McDonough,Sean P.McDonough,Thomas J.Divers,Yung-Fu Chang.Clinical and Vaccine Immunology.2013(8)

[3]Serological Analysis by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Using Recombinant Antigen LipL32 for the Diagnosis of Swine Leptospirosis[J].Cláudia P.Hartleben,Fernanda M.A.Leal,Leonardo G.Monte,Daiane D.Hartwig,Fabiana K.Seixas,Sílvio A.Vasconcellos,Bibiana Brihuega,Odir A.Dellagostin.Current Microbiology.2013(2)

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[6]Leptospiral Uveitis–There Is More to It Than Meets the Eye![J].A.Verma,B.Stevenson.Zoonoses and Public Health.2012

[7]Severe leptospirosis:case report of treatment with intravenous corticosteroids and supportive care[J].Kyle Minor.American Journal of Emergency Medicine.2012

[8]叶翠莲.钩端螺旋体外膜蛋白血清学诊断价值和CTB-OmpL1疫苗免疫保护作用评价[D].重庆医科大学,2014.