人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒的应用

背景^[1-3]

人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒是一种用于定量检测人血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中甲基化酶含量的实验工具。以下是对该试剂盒的详细介绍：

人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒

一、产品基本信息

产品名称：人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒

英文名称：Human Methylase ELISA Kit

规格：通常有48T和96T两种规格，分别代表可进行48次和96次检测。

存储条件：一般建议存储于2-8℃的冷藏环境中，也有产品推荐在4°C密封阴凉处保存。长期不使用时，可存储于-20℃。

保质期：通常为6个月。

二、产品特点

高效、灵敏、特异：试剂盒采用高效、灵敏、特异的抗体，能够准确检测样本中的甲基化酶含量。

适用多种样本类型：适用于血清、血浆、组织匀浆液、细胞培养上清液、尿液等多种标本类型。

操作简便：试剂盒提供详细的操作说明书，用户只需按照说明书步骤操作即可完成实验。

稳定性好：试剂盒中的组分经过严格的质量控制，确保实验的稳定性和重复性。

三、实验原理

人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒采用双抗体夹心法测定标本中甲基化酶的水平。具体步骤如下：

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

四、注意事项

试剂盒从冷藏环境中取出后应在室温平衡一段时间（如15-30分钟）后方可使用。

浓洗涤液在稀释时可能会有结晶析出，可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

标本采集后应尽早进行提取和实验，如需保存，应放置于-20℃或更低温度，避免反复冻融。

实验过程中应注意无菌操作，避免交叉污染。

应用^[4][5]

人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒可以用于DNA甲基化酶在尼罗罗非鱼性别分化和性腺发育中的功能研究

表观遗传研究不改变DNA序列下基因表达的可遗传改变,DNA甲基化是表观遗传学研究的重要内容,催化DNA发生甲基化的酶被称为DNA甲基化酶（DNA methyltransferases,dnmts）。硬骨鱼类特有的第三轮基因组复制增加了DNA甲基化酶家族成员数目,拥有1个维持DNA甲基化酶以及3-5个从头DNA甲基化酶。已有的研究表明在鱼类卵巢和精巢之间DNA甲基化水平存在巨大差异,在鱼类性逆转过程中,包括雌鱼向雄鱼性逆转以及雄鱼向雌鱼性逆转,性别决定和分化关键基因的DNA甲基化水平以及一些DNA甲基化酶家族成员的表达发生显著改变。这些结果暗示DNA甲基化酶在鱼类性别决定和分化过程中可能发挥着重要作用。然而,目前对DNA甲基化酶在鱼类性腺发育过程中的表达和功能鲜有报道。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是世界性的养殖鱼类,拥有XX/XY性别决定系统,其性别由遗传和环境因素共同决定。罗非鱼雄性比雌性生长快50%,性别决定和分化机制的解析有利于遗传育种。

本研究采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）、人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）分析了DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼性腺中的表达模式,采用DNA甲基化酶抑制剂解析了DNA甲基化酶在性腺发育以及性别分化中的功能,构建dnmt3aa和dnmt3ab突变系进一步揭示了其在性腺发育中的作用。

人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒主要研究结果如下:1、DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼性腺发育中的表达研究。尼罗罗非鱼DNA甲基化酶家族有6个成员,包括一个维持甲基化酶dnmt1,以及5个从头甲基化酶dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1、dnmt3bb.2。q RT-PCR分析显示DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼性腺不同发育时期（5、30、60、90、120和180 days after hatching,dah）呈性二态性表达,dnmt1和dnmt3ba在卵巢中的表达显著高于精巢,dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在精巢中的表达高于卵巢。人甲基化酶(Methylase)Elisa试剂盒及荧光原位杂交显示,dnmt1、dnmt3aa、dnmt3ba、dnmt3bb.1、dnmt3bb.2高表达于卵巢卵原细胞、I时相和II时相卵母细胞、颗粒细胞以及精巢精原细胞和精母细胞,dnmt3ab高表达于卵巢颗粒细胞以及精巢精原细胞和精母细胞。

参考文献

[1]Sexual determination in zebrafish.[J].Aharon Devora;Marlow Florence L.Cellular and molecular life sciences:CMLS,2021

[2]Sexual dimorphism of DNA and histone methylation profiles in the gonads of the olive flounder Paralichthys olivaceus.[J].Liu Yan;Wang Wenxiang;Liang Shaoshuai;Wang Lijuan;Zou Yuxia;Wu Zhihao;Zou Congcong;Wu Qiaowan;You Feng.Fish physiology and biochemistry,2021

[3]Comprehensive analysis of genome‐wide DNA methylation and transcriptomics between ovary and testis in Monopterus albus[J].Chen Mei;Ruan Rui;Zhong Xuqing;Ye Huan;Yue Huamei;Li Zhong;Li Chuangju.Aquaculture Research,2021

[4]Potential role of DNA methylation of cyp19a1a promoter during sex change in protogynous orange-spotted grouper,Epinephelus coioides.[J].Guo ChunYang;Tseng PengWei;Hwang JiangShiou;Wu GuanChung;Chang ChingFong.General and comparative endocrinology,2021(prep)

[5]王飞龙.DNA甲基化酶在尼罗罗非鱼性别分化和性腺发育中的功能研究[D].西南大学,2022.