人脐动脉内皮细胞培养

发布日期:2020/2/20 8:45:53

背景及概述^[1]

人脐动脉内皮细胞分离自脐带组织；它是脐动脉的重要结构组成细胞之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是哺乳类的连接胎儿和胎盘的管状结构，脐带中通过尿膜的血管即脐动脉和脐静脉，卵黄囊的血管即脐肠系膜动脉及脐肠系膜静脉。在子宫中，子宫动脉在胎盘的母体部分出的毛细血管，与胎盘的子体部胎儿毛细血管靠近，在此处母体和胎儿的血液间进行CO₂和O₂，代谢产物即代谢废物和营养物质的交换。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将O2和营养物质从胎盘运送给胎儿。

相关研究^[2-3]

有研究在未用贴附基质和生长因子情况下，成功地培养了人脐动脉内皮细胞(humanumbilicalarteryendothelialcell，HUAEC)。接种密度为1×10~5/cm~2。采用HE染色、显微计量法及透射电镜术研究了内皮细胞的形态、生长行为与增殖。(1)接种后24h已出现岛状细胞团；48h细胞团增大，可区分出细胞密集的中央区及细胞密度较小的周边区；72h大部分细胞团已汇合；216h内皮细胞衰退、脱落。(2)HUAEC呈较长的多边形，相邻细胞间以短突相连，内胞质呈颗粒状弱嗜碱性，外胞质扁薄。(3)一个细胞团所含平均细胞数，24h为17.39±3.79个；48h为131.14±22.83个，72h为454.16±111.39个，表明在接种后72h内细胞倍增9次。(4)在细胞呈指数生长的24～72h时出现许多无丝分裂像，但未见有丝分裂像；至120h细胞生长缓慢时才出现有丝分裂像。(5)电镜下可见内皮细胞含Weibel-Palade小体。

此外，还有研究建立人脐动脉内皮细胞-平滑肌细胞共培养模型，以体外模拟人动脉壁，为动脉粥样硬化及炎症等疾病的发病机制和治疗研究打下基础。方法采用胶原酶灌注消化法从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉内皮细胞(humanumbilicalarteryendothelialcell，HUAEC)，采用组织块贴块法从人脐动脉中原代培养获得人脐动脉平滑肌细胞(humanumbilicalarterysmoothmusclecell，HUASMC)。用含有抗坏血酸(≥50μg/mL)的培养基孵育平滑肌细胞，使之合成并分泌胶原蛋白，形成内皮细胞的生长基质；然后将内皮细胞以饱和密度接种到平滑肌细胞上，使内皮细胞和平滑肌细胞直接接触并整合形成内皮细胞-平滑肌细胞共培养(EC-SMCco-culture)模型。分别用免疫荧光染色和Dil-Ac-LDL吞噬实验对共培养模型进行形态学和功能学的鉴定。结果形态学鉴定结果显示，两种细胞已成功整合，模拟出体内动脉壁的形态。Dil-Ac-LDL吞噬实验的结果显示共培养模型的内皮细胞中有荧光信号，并且共培养模型中内皮细胞Dil-Ac-LDL的内吞量显著高于单纯内皮细胞(ECmonocultureorECmonolayer)，证明共培养模型中内皮细胞与平滑肌细胞已建立联系。

另外，应用双光子激光扫描共聚焦显微镜鉴定体外培养的脐动脉内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs)，应用荧光光漂白恢复技术(FRAP)测定血管ECs、SMCs之间的缝隙连接通讯(GJIC)功能。方法：人脐动脉ECs、SMCs分离培养，Ⅷ因子和SMα-actin相关抗原鉴定ECs和SMCs，应用FRAP技术测定血管内皮细胞、平滑肌细胞之间的GJIC功能，记录实时成像结果，应用动态比(M)计算漂白区域内标记荧光的分子中动态分子的比例。结果：组ECs和SMCs单独培养，选择漂白细胞与周围至少3个同种细胞相连接，SMCs被漂白后平均M值为31.79±5.69；ECs被漂白后平均M值为23.43±2.11；第二组ECs和SMCs混合培养，选择ECs和SMCs独立相连的2个细胞，SMCs被漂白后平均M值为14.47±3.28，ECs被漂白后平均M值为6.41±0.80。结论：FRAP实时动态恢复曲线可直接观察荧光恢复强度及速度，参照FRAP恢复曲线，M值可做为组间GJIC比较相对定量的可靠指标，通过检测证实ECs和SMCs之间存在GJIC，且荧光由ECs向SMCs方向的传递大于由SMCs向ECs方向的传递。