新橙皮苷的制备与研究

简述

新橙皮苷不仅是一种重要的天然黄酮类化合物，而且还是合成新橙皮苷二氢查尔酮的重要原材料[1]。常温常压下，新橙皮苷是白色针状晶体，易溶于热水，溶于热乙醇，不溶于乙醚。其遇三氯化铁呈棕色。由镁及盐酸还原，呈红色。在碱溶液中通入二氧化碳，也不析出。加2%盐酸或硫酸进行水解时，产生橘皮素、葡萄糖、鼠李糖各一分子。

新橙皮苷（Neohesperidin）和橙皮苷是同分异构体，且能够进一步氢化生成新橙皮苷二氢查耳酮（Neohesperidindihydrochalcone,NHDC）,NHDC 比蔗糖甜 1000～1500 多倍且热量低，不会影响人体的血糖和血脂水平，是一种具有巨大应用潜力的食品添加剂[2]。

制备方法

新橙皮苷是一种植物类黄酮化合物，作为天然抗氧化剂，它可以在体内发挥抗氧化作用，对健康有益。文献报道的由橙皮苷转化为新橙皮苷的生物酶法步骤如下[2]：

（1）使用α-L-鼠李糖苷酶特异性水解α-1,6-鼠李糖苷键生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷（Hesperetin-7-O-glucoside,H7G）;

（2）以H7G为受体，UDP-Rha为供体，在柚子来源的α-1,2-鼠李糖基转移酶（Cm1,2RhaT）的催化下特异性地在H7G的葡萄糖分子上合成α-1,2-鼠李糖苷键生成新橙皮苷。

虽然已有报道显示，橙皮苷可以通过酶法水解和酸水解去除鼠李糖生成橙皮素-7-O-葡萄糖苷，但是目前已有的方法均不能选择性去除鼠李糖基，会同时发生鼠李糖基和葡萄糖基的全部去除，不适合规模化应用。目前对于柚子来源的鼠李糖基转移酶（Cm1,2RhaT）的研究报道都集中在体外以H7G为受体底物转鼠李糖基利用烟草细胞粗酶液生成产量较低的新橙皮苷（产量为0.05～0.08mM），规模化制备新橙皮苷还面临着巨大的挑战。因此建立橙皮苷的鼠李糖基的选择性酶法水解高效制备H7G，进一步以H7G为底物建立新橙皮苷的一锅生物酶法合成体系，实现绿色高效的以橙皮苷为原料制备新橙皮苷，具有重要的科学意义和应用价值。

测定方法

高效液相色谱法测定柑橘皮中新橙皮苷含量的方法[3]，步骤如下：样品用甲醇超声提取，定容至50mL。以SinoChrom ODS-BP色谱柱(250mm×4.6mm,10μm)为分离柱，以甲醇-水(36+64)溶液作为流动相，用紫外检测器在波长283nm处进行测定。新橙皮苷质量浓度在0.005 3～0.32g.L^-1范围内与其峰面积呈线性关系，方法的检出限(3S/N)为0.6mg.L^-1。方法的平均回收率为90.3%，相对标准偏差(n=6)为1.7%。

生理活性

为了研究新橙皮苷对脂肪细胞脂肪形成的影响及其作用机制，采用MTS法检测新橙皮苷对3T3-L1前脂肪细胞的细胞活力的影响。确定新橙皮苷的作用浓度后，油红O染色法和分光光度法测定3T3-L1脂肪细胞的分化及胞内甘油三酯的含量，RT-PCR测定脂肪形成相关基因CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)和过氧化物酶体增殖激活受体γ(Peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)m RNA表达，Western蛋白印迹法检测蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB/Akt)、糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase3β,GSK3β)和糖原合成酶(Glycogen synthase,GS)的磷酸化水平。利用GSK3β选择性的抑制剂LiCl作用3T3-L1脂肪细胞后，检测新橙皮苷对3T3-L1细胞分化、胞内甘油三酯含量、C/EBPα、PPARγ及aP2蛋白表达的影响。

结果表明，新橙皮苷能极显著抑制脂肪细胞分化和胞内甘油三酯的形成(P<0.01)，激活Akt信号通路，促进p-Akt和p-GSK3β水平增加，极显著抑制C/EBPα、 PPARγ、 aP2 mRNA和蛋白表达(P<0.01)。新橙皮苷的这些影响部分地被GSK3β抑制剂LiCl所抑制(P<0.01)。故得出结论，新橙皮苷能够通过激活Akt/GSK3β信号通路抑制脂肪细胞分化。

聚合研究

有关文献公开了一种新橙皮苷-柚皮苷簇聚体制备方法与应用。首次发现柚皮苷和新橙皮苷可以互为增溶剂，柚皮苷和新橙皮苷可以稳定地溶解在水中且不析出，可以得到浓度较高的新橙皮苷-柚皮苷水溶液，进而拓宽新橙皮苷的应用范围。新橙皮苷-柚皮苷水溶液进一步干燥，得到新橙皮苷-柚皮苷簇聚体，新橙皮苷-柚皮苷簇聚体加入适量的水中，经过振摇或短时的超声即可溶解。由于新橙皮苷-柚皮苷簇聚体溶解性提高，可以将新橙皮苷-柚皮苷簇聚体更方便、广泛地在食品、医药和日化工业领域中应用，以制备医药和日化产品[5]。

毒性研究

实验室研究显示，新橙皮苷具有良好的降血糖和降血脂效果，具有潜在的临床应用价值。为了考察新橙皮苷的生殖发育毒性，包括亲代动物配子形成、交配、受孕、分娩、哺乳以及对子代生长发育等过程的不良影响，为新橙皮苷的进一步研发和应用提供实验室资料。试验条件下，SD大鼠灌胃给予0.45、0.9、1.8 g/kg剂量新橙皮苷后，对生育力与早期胚胎发育以及围产期未见明显毒性反应，对胚胎-胎仔的发育具有一定的毒性反应，主要毒性可能为延缓骨骼骨化以及影响脑和食管发育[6]。

参考文献

[1]陈春玉,李毅,黄超明,等.新橙皮苷的制备工艺及应用进展[J].天然气化工(C1化学与化工),2014,39(03):81-87.

[2]季璇.新橙皮苷的一锅生物酶法合成[D].山东大学,2020.DOI:10.27272/d.cnki.gshdu.2020.007039.

[3]徐旭耀,苏欣,汪秋安.高效液相色谱法测定柑橘皮中新橙皮苷[J].理化检验(化学分册),2012,48(03):342-344.

[4]郭莉霞,孔淑贞,殷钟意,等.新橙皮苷对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及其作用机制[J].食品工业科技,2021,42(12):125-132.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.20201001641.

[5]姜华,一种新橙皮苷—柚皮苷簇聚体及其制备方法与应用.河南省,河南科技大学,2021-01-01.

[6]林春琴.新橙皮苷生殖发育毒性研究[D].浙江大学,2019.DOI:10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.000961.