人胚胎滋养层细胞的分离纯化

背景及概述^[1]

人胎盘滋养层细胞分离自正常人胎盘滋养层组织，胎盘滋养层细胞主要功能：（1）胚胎滋养层是母亲子宫内膜和发育中胚胎之间的营养通路。（2）紧贴在子宫壁的滋养层是胚胎着床必不可少的步骤，随后形成胎盘。（3）覆盖着胎盘绒毛的人绒毛膜滋养层细胞提供母亲循环中氧和营养物质交换的介面。（4）它们合成和释放绒毛膜促性腺激素，胎盘催乳激素和血管生成素，表达CXCR4，CCR5和泌乳刺激素基因家族。

分离纯化^[1]

胎盘的细胞成分较复杂，其中所包含的人胚胎滋养层细胞在母胎免疫耐受过程中起重要作用，胎盘间充质干细胞具有多向分化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性，常规分离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞。有研究建立一次操作即可同时获得大量、较高纯度的人胚胎滋养层细胞和胎盘间充质干细胞的操作方案。人胎盘组织洗净剪碎，采用胰蛋白酶和DNAseⅠ共同消化，分3个阶段，每个阶段在恒温37℃下180r/min消化2min。重悬消化产物，200目筛网过滤后采用Percoll密度梯度分离液分离，分别收集人胚胎滋养层细胞和胎盘间充质干细胞层。

人胚胎滋养层细胞以差速贴壁法去除成纤维细胞，胎盘间充质干细胞直接接种于75cm2培养瓶中培养。观察胎盘组织消化情况，计数人胚胎滋养层细胞数量及其细胞角蛋白7的表达，观察胎盘间充质干细胞生长增殖、表型及成骨分化潜能。结果经胰蛋白酶和DNAseⅠ消化后，胎盘组织仅剩少许残渣。差速贴壁后，人胚胎滋养层细胞数达(5.48±1.98)×108个，细胞角蛋白7阳性率为(90±4.36)%。胎盘间充质干细胞接种19～21d达90%融合，细胞数为(1.96±0.24)×106个，强表达CD29，CD44和HLA-ABC，不表达CD34，CD45，CD14和HLA-DR，诱导后茜素红染色呈鲜艳橙红色，可向成骨细胞方向分化。提示采用胰蛋白酶和DNAseⅠ共同消化胎盘组织，并结合Percoll不连续密度梯度分离液分离细胞，可同时一次性获得大量的人胚胎滋养层细胞和较多的胎盘间充质干细胞，细胞纯度和活性均较好。

相关研究^[2]

有研究探讨牙龈卟啉单胞菌对人胚胎滋养层细胞的影响及p-Akt在此过程中的作用。牙龈卟啉单胞菌ATCC33277(Porphyromonasgingivalis)以感染复数(MOI)为200∶1与人胚胎滋养层细胞(HTR-8)共培养，以单纯培养人胚胎滋养层细胞为对照组；采用siRNA失活PI3K；选择倒置显微镜和共聚焦显微镜记录人胚胎滋养层细胞的形态变化；采用流式细胞术检测感染后人胚胎滋养层细胞凋亡的情况；用RealTime-PCR检测PI3KsiRNA敲低的效果。

结果：牙龈卟啉单胞菌感染人胚胎滋养层细胞12h时，细胞的凋亡率与正常组相比无统计学意义；感染24h时，细胞凋亡明显增多(P<0.01)；感染48h时，细胞凋亡与对照组相比更为明显(P<0.001)。siRNA预先处理HTR-8细胞再与牙龈卟啉单胞菌共培养48h后，siRNA处理组的PI3KmRNA的相对量明显低于干扰组(P<0.01)；同时，细胞凋亡率>45%，明显高于单纯感染牙龈卟啉单胞菌组(P<0.01)，而干扰组的细胞凋亡率与单纯刺激组相比无统计学差异。结论：牙龈卟啉单胞菌能够诱导胚胎滋养层细胞发生凋亡。在此过程中，p-Akt被激活，并对凋亡有一定的抑制作用。提示，牙周炎促使早产低体重儿的娩出与牙龈卟啉单胞菌诱导胚胎滋养层细胞凋亡有关。

主要参考资料

[1] 人胚胎滋养层细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化

[2] p-Akt对牙龈卟啉单胞菌诱导的人胚胎滋养层细胞凋亡的影响