金合欢素的性质研究与检测

简述

金合欢素又名5,7-二羟基-4'-甲氧基黄酮，是一种广泛存在于自然界的天然黄酮类化合物，分子式和分子量分别为C₁₆H₁₂O₅，284.26，表现为黄色粉末。金合欢素可以从金合欢树、洋槐树、大蓟、飞机草、密蒙花、菊花中提取纯化，多用于医学研究和化妆品行业。目前发现金合欢素具有多重生物活性，如抗氧化、抗炎抑菌、抗骨质疏松、抗肿瘤、免疫调节、保护心脏和神经系统等功效，可能对人类的健康有极大帮助[1]。

性质研究

保护脑缺血再灌注损伤

为探讨金合欢素调节Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)信号通路对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用及其相关机制。将Wistar大鼠随机分为假手术组，模型组，金合欢素低剂量组，金合欢素高剂量组，尼莫地平组，每组10只。除假手术组外，采用改进缝合方法建立大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型，建模24 h后评估各组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积。采用ELISA法检测脑组织白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，丙二醛(malondialdehyde,MDA)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。采用Western blot法检测大鼠脑组织中B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphonoma-2,Bcl-2)，Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)及TLR4/NLRP3信号通路相关蛋白(TLR4,p-NF-κB/NF-κB,NLRP3,pro-caspase-1,cleaved caspase-1,pro-IL-1β,cleaved IL-1β)的表达水平。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察缺血区脑组织病理学变化。结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分，脑梗死体积以及脑组织IL-1β，IL-6，TNF-α，MDA水平均显著升高(P<0.05)，而脑组织SOD，GSH水平均显著降低(P<0.05)。与模型组比较，金合欢素低，高剂量组和尼莫地平组大鼠神经功能缺损评分，脑梗死体积以及脑组织IL-1β，IL-6，TNF-α，MDA水平均显著降低(P<0.05)，而脑组织SOD，GSH水平均显著升高(P<0.05)。与假手术组相比，模型组脑组织中Bax，TLR4，p-NF-κB/NF-κB，NLRP3，pro-caspase-1，cleaved caspase-1，pro-IL-1β，cleaved IL-1β蛋白表达均显著上调(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著下调(P<0.05)。与模型组相比，金合欢素低，高剂量组和尼莫地平组脑组织中Bax，TLR4，p-NF-κB/NF-κB，NLRP3，pro-caspase-1，cleaved caspase-1，pro-IL-1β，cleaved IL-1β蛋白表达均显著下调(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.05)。综上，金合欢素可通过调节TLR4/NLRP3信号通路，抑制神经炎症反应和氧化应激，实现对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[2]。

提高癌细胞药物敏感性

以某医院采用金合欢素，顺铂(DDP)或联合用药作用于人卵巢癌SKOV3及SKOV3/DDP细胞系为实验对象进行实验研究。根据实验结果可得出结论，金合欢素可提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，其机制可能与抑制ABCA3的表达增加细胞内DDP药物累积有关[3]。

抑制骨肉瘤细胞生长

实验研究金合欢素（ACA）在体外和体内对人骨肉瘤细胞的影响及机制。方法：体外培养人骨肉瘤细胞，分别给予不同浓度的ACA处理，结晶紫染色、MTT实验、克隆形成实验检测细胞增殖，FCM检测细胞周期，Hoechst染色和FCM检测细胞凋亡，划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。用同样浓度的ACA处理人正常细胞，MTT实验、FCM检测细胞增殖和凋亡。WB检测相关蛋白水平。用β-catenin过表达病毒(Ad R-β-catenin)和JNK抑制剂(SP600125)分别与ACA联合处理骨肉瘤细胞，观察挽救效果。构建骨肉瘤的裸鼠股骨原位成瘤模型，HE染色和IHC分析ACA在体内对骨肉瘤细胞的作用。结果：结晶紫染色、MTT实验、克隆形成实验和FCM结果表明，ACA可抑制骨肉瘤细胞的增殖，并将MG63细胞阻滞在G2/M期，且增殖相关蛋白(PCNA、Cyclin D1、c-Myc)的蛋白水平下降。Hoechst染色和FCM结果表明，ACA可促进骨肉瘤细胞的凋亡，且抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白水平下降，促凋亡蛋白(Bax、Bad)、凋亡标志蛋白(c-Caspase3、c-PARP)的蛋白水平升高。划痕愈合实验和Transwell实验结果表明，ACA可抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，且MMP-2/7/9、Snail、Vimentin和N-cadherin的蛋白水平下降，E-cadherin的蛋白水平升高。同时，磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β(ser9))、β-catenin蛋白水平下降，磷酸化JNK(p-JNK)蛋白水平升高。MTT实验、FCM结果表明，ACA对正常细胞的增殖、凋亡无明显影响。Ad R-β-catenin和SP600125处理后，ACA对骨肉瘤细胞的作用可部分逆转。小鼠体内骨肉瘤的恶性程度和肺转移均被ACA有效抑制，且肿瘤组织的PCNA、Bcl-2、β-catenin蛋白水平下降，E-cadherin、p-JNK蛋白水平升高。根据以上的实验结果可以得出结论：金合欢素（ACA）在体外可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进其凋亡，但对正常细胞的增殖、凋亡影响很小，ACA在体内可抑制骨肉瘤细胞的生长和转移。其分子机制可能与下调Wnt/β-catenin和上调JNK信号通路活性有关[4]。

检测方法

采用高效薄层色谱扫描法(HTLCS)可以同时测定滁菊中木犀草素、芹菜素和金合欢素的含量。方法：采用硅胶GF254高效薄层板条带点样，以甲苯：乙酸乙酯∶甲酸∶水=17∶7∶3∶2上层溶液为展开剂，上行展开，于365nm波长下进行直线扫描，测定滁菊中的木犀草素、芹菜素、金合欢素的含量。结果：分别在0.066 1～0.335 2μg(r=0.999 9)、0.068 4～0.333 8μg(r=0.997 9)、0.064 0～0.334 2μg(r=0.995 2)范围内，木犀草素、芹菜素、金合欢素线性关系良好，平均回收率分别为99.9%、100.65%、101.3%，RSD分别为1.55%、1.41%、1.64%。结论：以HTLCS为质量控制方法，建立了一种简便、快速、准确的药物检测方法[5]。

应用

从怀菊花中提取的金合欢素可以应用于制备雌激素样药物的应用。将怀菊花用丙酮组织破碎提取两次，合并滤液，低温减压浓缩得总浸膏。总浸膏用水分散溶解，用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，取干燥后的乙酸乙酯部位，以乙酸乙酯溶解，硅胶拌匀后蒸干，硅胶柱层析，洗脱液旋干水溶上Toyopearl HW40，依次用水及不同比例的含水甲醇梯度洗脱，洗脱部分依次上sephadexLH20，ODS，Silica gel，MCL Gel CHP20柱，结合制备高效液相和重结晶的方法分离纯化，得怀菊花金合欢素。上述研究首次发现怀菊花金合欢素在体内有雌激素样作用，且是通过雌激素受体途径发挥作用的，开辟了金合欢素的新用途[6]。

参考文献

[1]马纳,李亚静,范吉平.金合欢素药理研究进展[J].中国现代应用药学,2018,35(10):1591-1595.DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.10.035.

[2]林兰明,宋征宇,胡瑾.金合欢素调节TLR4/NLRP3信号通路对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[J].中国中药杂志, 2023, 48(22):6107-6114.

[3]彭佳欣,张自辉,洪莉.金合欢素逆转卵巢癌铂耐药的机制研究[J].中国实用妇科与产科杂志, 2023, 39(8):842-848.

[4]魏梦琪. 金合欢素对骨肉瘤细胞的影响及机制[D].重庆医科大学,2023.DOI:10.27674/d.cnki.gcyku.2022.001439.

[5]蔡玉茹,江倩,李洒洒,等.高效薄层色谱扫描法同时测定滁菊中木犀草素、芹菜素、金合欢素含量[J].安徽科技学院学报,2019,33(01):51-55.DOI:10.19608/j.cnki.1673-8772.2017.0566.

[6]郑晓珂,傅阳,克迎迎,等.一种从怀菊花中提取的金合欢素在制备雌激素样药物中的应用:CN201911087383.X[P].CN110721178A.