大鼠皮肤成纤维细胞的培养

背景及概述^[1-2]

成纤维细胞是疏松结缔组织中最常见而且数量较多的一种细胞，位于胶原纤维近旁并依附于其上。此细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。在功能活动旺盛时，成纤维细胞的胞体较大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圆形，核染色质较少，着色浅，核仁明显。胞质较多，弱硷性，内含丰富的粗面内质网、核蛋白体、高尔基复合体以及微丝和微管等结构，表明此种细胞具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和多糖蛋白，形成胶原纤维、弹性纤维、网状纤维和基质的作用。在相对静止或功能活动不活跃时的细胞，称为纤维细胞。这种细胞比成纤维细胞小，轮廓不甚清楚，多呈梭形。胞质少，弱嗜酸性，其中粗面内质网、高尔基复合体及其它细胞器均不发达。这表明纤维细胞是功能活动不活跃的细胞。但在一定条件下，如创伤修复，结缔组织再生时，纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞，积极参与合成和分泌蛋白质，形成纤维和基质。原代培养大鼠胚胎成纤维细胞常采用酶消化法，但步骤多，过程复杂，并且酶本身对细胞贴壁有一定影响，多次离心也会导致细胞收到损伤和数量丢失，组织块培养法相对酶消化法步骤简单，容易掌握，操作过程中不易发生污染，细胞成活率高，简单易行。

培养^[2]

养取新出生的SD大鼠，断颈处死，在75%乙醇中浸泡3~5分钟。在无菌条件下，剪取大乳鼠背部皮肤。去除皮下组织，PBS溶液反复漂洗后，将组织块剪切成约1立方毫米的小块，0.25%中性蛋白酶在4℃处理12~16小时，去除表皮，将剩余的真皮组织以0.3～0.5毫米间距接种于培养瓶内壁，加入少量DMEM培养液，置入5%CO2，37℃的CO2培养箱中培养24小时，待组织块吸附牢固后，次日补加培养液至正常体积，三天后换液。当成纤维细胞汇合成片，占培养瓶底面的80%左右时，加入PBS溶液洗涤2次，加入少量0.25%胰蛋白酶覆盖瓶底，消化3～5分钟，当细胞间隙变大，胞质回缩时，加入含有小牛血清的培养基终止消化，由上至下，由左至右吹打瓶壁，细胞脱落后，以1200转/分钟离心5分钟，弃上清加入10%小牛血清的DMEM培养基重悬，台盼蓝染色进行细胞计数，按照8×10⁴密度接种培养。当细胞培养至第5代，第10代分别进行常规冻存，以便需要时复苏。

接种后，4小时左右开始贴壁生长，1～3天游离出的细胞开始贴壁，细胞变为梭形。随着时间延长，原代培养的细胞汇合成片，7天后长满单层，细胞伸展呈现梭形和多边形，体积变大，细胞中央有卵圆形的细胞核，胞质向外伸出2~3个不规则的生长突。细胞在生长时总体呈放射火焰状或旋涡状生长。

HE染色观察经过HE染色的细胞，形状为多角形或长梭形，可见细胞核位于细胞的中央，细胞核被染成淡蓝色，细胞质被染成粉红色。

相关研究^[3-4]

有研究探讨虾青素对辛硫磷所致大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤及凋亡的拮抗作用。方法取4只3日龄清洁级SD大鼠背部皮肤培养。取第4代成纤维细胞，正常对照组和辛硫磷氧化损伤组更换新鲜培养基，低、中、高剂量虾青素保护组分别更换含0.2、2、20μg/L虾青素的培养基，于37℃、5%CO2培养24h后，正常对照组更换新鲜培养基，辛硫磷氧化损伤组和各剂量虾青素保护组分别更换含10μg/L辛硫磷的培养基，于37℃、5%CO2培养24h。采用噻唑兰(MTT)比色法检测细胞存活率；采用流式细胞术检测细胞凋亡率；测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量。结果与对照组比较，辛硫磷染毒组和虾青素保护组大鼠皮肤成纤维细胞存活率和SOD、CAT活力下降，凋亡率和MDA含量升高。与辛硫磷染毒组比较，虾青素保护组大鼠皮肤成纤维细胞存活率和SOD、CAT活力较高，凋亡率和MDA含量下降；且随着虾青素剂量的升高，辛硫磷染毒大鼠皮肤成纤维细胞存活率和SOD、CAT活力呈上升趋势，凋亡率和MDA含量呈下降趋势。结论虾青素对辛硫磷所致的大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤及凋亡具有明显的拮抗作用。

此外，还有实验研究地骨皮对热损伤皮肤成纤维细胞的保护作用及其有效部位。方法MTT法测定地骨皮石油醚提取部位、水提取部位、正丁醇提取部位对正常乳大鼠皮肤成纤维细胞的影响，对获得的有效部位在经50℃的恒温水浴损伤30min的皮肤成纤维细胞上进行药效验证，流式细胞仪检测热损伤皮肤成纤维细胞的凋亡变化。结果地骨皮正丁醇提取部位(0.8，0.2mg/ml)，水提取部位(0.8，0.2mg/ml)会显著抑制大鼠皮肤成纤维细胞的增殖(P<0.05)，石油醚提取部位(0.6，0.4，0.2mg/ml)能显著促进其增殖(P<0.05)；流式结果显示，地骨皮石油醚提取部位对已损伤的皮肤成纤维细胞有促进凋亡的作用。结论三种提取部位中，地骨皮石油醚提取部位可以促进已损伤皮肤成纤维细胞的凋亡，促进正常细胞的新生。

主要参考资料

[1] 运动解剖学、运动医学大辞典

[2] 大鼠皮肤成纤维细胞分离培养方法的研究

[3] 虾青素对辛硫磷所致大鼠皮肤成纤维细胞氧化损伤的拮抗作用

[4] 地骨皮提取物对热损伤大鼠皮肤成纤维细胞的保护作用