Protein A Agarose

背景^[1-4]

Protein A Agarose(Fast Flow,进口分装)主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗体的纯化。Protein A Agarose适合于免疫沉淀mouse IgG2a,IgG2b,IgA,rabbit IgG,以及human IgG1,IgG2和IgG4。Protein A是最初在细菌金黄色葡萄球菌细胞壁中发现的42kDa表面蛋白。它由spa基因编码，其调节受DNA拓扑结构，细胞渗透压和称为ArlS-ArlR的双组分系统控制。

由于其结合免疫球蛋白的能力，它已被发现用于生物化学研究。它由五个同源的Ig结合结构域组成，折叠成三螺旋束。每个结构域能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白质，最值得注意的是IgG。它结合大多数免疫球蛋白的Fc区内的重链以及内部的重链在人VH3家族的情况下的Fab区域。通过血清中的这些相互作用，其中IgG分子以错误的方向结合（与正常抗体功能相关），细菌破坏调理作用和吞噬作用。

Protein A在工业发酵中产生和纯化，用于免疫学，生物学研究和工业应用。天然（或天然）蛋白A可以在金黄色葡萄球菌中培养，并含有上述五个同源抗体结合区和用于细胞壁附着的C-末端区。今天，蛋白质A更常见地在大肠杆菌中重组产生。（Brevibacillus也被证明是一种有效的宿主）蛋白A的重组形式也含有五个同源抗体结合域，但可能在结构的其他部分有所不同，以促进与多孔底物的偶联该蛋白质的工程版本也可用，其中个是rProtein A，B4，C-CYS。

工程版本是单个域的多聚体（通常是四聚体，五聚体或六聚体），其经过修饰以改善工业应用中的可用性。Protein A通常与其他分子偶联，例如荧光染料，酶，生物素，胶体金或放射性碘，而不影响抗体结合位点。包括蛋白A-gold（PAG）染色的实例用于免疫金标记，荧光团偶联蛋白A用于免疫荧光，DNA对接链偶联蛋白A用于DNA-PAINT成像。它还广泛用于磁性，乳胶和琼脂糖珠。蛋白A通常固定在固体支持物上，并用作从粗蛋白质混合物如血清或腹水中纯化总IgG的可靠方法，或与上述标记之一偶联以检测抗体的存在。

应用^[5][6]

1.用于亲和层析法快速分离纯化血清IgM

采用Protein A亲和层析法对鲫Carassius auratus血清中的IgM进行快速分离纯化,所得产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blotting)进行分析检测。结果表明:采用Protein A亲和层析法可以很好地分离到高纯度的鲫血清IgM,电泳条带中重链和轻链清晰可辨,重链、轻链的相对分子质量分别为85 000、25 000左右,无明显杂带;利用纯化的鲫血清IgM免疫小鼠,获得了高效价抗IgM抗血清,可以特异性识别鲫血清和黏液中IgM重链。

应用间接ELISA方法对浸泡免疫后的鲫血清和皮肤黏液中抗体的动态进行检测,结果显示:鲫皮肤黏液中的抗体滴度在免疫后第6天达到峰值,血清中抗体滴度在免疫后第15天达到峰值,前者高峰期出现较早,但持续时间短,后者高峰期出现较晚,但持续时间较长。

2. 用于反向免疫共沉淀技术纯化高活性BTV

以蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）为模型,结合有限的离心和琼脂糖蛋白质A沉淀目标生物大分子的背景杂质,达到获取高纯度,高活性生物大分子的目的。该方法与传统的技术不同,沉淀的不是目标物质,而是背景杂质,故命名为琼脂糖蛋白质A反向免疫共沉淀技术（Protein A intermediary reverse co-immunoprecipitation,PARIP）。

反复冻融破碎裂解的未感染病毒的Vero细胞800rpm离心10分钟后,取上清,制备成抗原,以常规方法免疫家兔,制备抗Vero细胞碎片和抗小牛血清的多克隆抗体。在一定的温度、pH值、反应时间和振荡速度等条件下,利用蛋白质A能与IgG抗体非特异性牢固结合的特点,将免疫家兔所得多克隆抗体耦联到琼脂糖Protein A上;再利用抗体抗原特异性结合的特点,以此耦联了抗体的琼脂糖Protein A去吸附细胞培养病毒增殖混合悬液（经12000rpm,15min离心去沉淀）中的Vero细胞碎片及小牛血清抗原。

发生上述反应的试管以1000rpm,15min低速离心,可使介质琼脂糖Protein A及其上附着的抗原抗体复合物沉淀下来,上清即为纯化的含单一病毒成分的悬液。琼脂糖双向免疫扩散检测纯化后的病毒悬液,悬液中不含抗Vero细胞碎片及小牛血清抗原的抗体。介质琼脂糖ProteinA上吸附的抗原抗体复合物可用缓冲液B洗去后继续使用。用透射电镜观察病毒纯化效果,纯化后的病毒悬液背景清晰,病毒粒子多且轮廓清楚。

参考文献

[1]The kinetics of antibody pro-duction in mucus and serum of European eel after vaccination a-gainstVibrio vulnicus:development of a new method for antibodyquantification in skin mucus.Esteve MD,Nielsen ME,Amaro C.Fish&Shellfish Immunol.2003

[2]Monoclonal antibodies against sea bass Dicentrarchus labrax(L.)immunoglobulins:immunolocalisation of immunoglobulin-bearing cells and applicability in immunoassays.Scarpigliati G,Romano N,Picchietti S,et al.Fish and Shellfish Immunology.1996

[3]Production of monoclonalantibodies against serum immunoglobulins of black rockfish(SebastesschlegeliHigendorf).Shin G,Lee H,Palaksha KJ,et al.Journal of Veterinary Science.2006

[4]Characterisation of mucosal and systemic immune responses in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)using surface plasmon resonance.CainKD,,JonesD R,Raison RL.Fjsh Shellfish Immuno1.2000

[5]吴光辉,王庆,巩华,石存斌,李华,吴淑勤.用Protein A亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用[J].大连海洋大学学报,2010,25(03):233-237.

[6]吴光辉,王庆,巩华,石存斌,李华,吴淑勤.用Protein A亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用[J].大连海洋大学学报,2010,25(03):233-237.