TaqDNA连接酶的相关研究

背景及概述^[1]

DNA连接酶在DNA的复制、重组和修复过程中扮演重要角色。它以ATP或NAD+作为辅酶来催化2个DNA链之间的3’-羟基（3’-OH）和5’-磷酸（5’-P）形成磷酸二酯键。这2类连接酶的反应机理相近：（1）NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连酶赖氨酸残基的ε-氨基上，形成酶-腺苷酸共价复合物中间体，同时释放出烟酰胺单核苷酸或焦磷酸；（2）然后，酶-腺苷酸共价复合物上的腺苷酰基转移到DNA链的5’-P，形成被激活的焦磷酸键；（3）最后，相邻链的3’-OH与被激活的5’-P结合在2条链之间形成磷酸二酯键，同时释放出一磷酸腺苷（AMP）。常用的DNA连接酶有Ｅ．ｃｏｌｉDNA连接酶、T4DNA连接酶和TaqDNA连接酶等。T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，是ATP依赖的DNA连接酶，可连接双链DNA的黏性末端和平末端。但它只能在低于37℃的温度下使用，且对于碱基错配不敏感。Taq　DNA连接酶热稳定性高，是NAD+依赖的连接酶，在45～65℃均有很强的活性。随着生物技术的深入发展，连接酶的应用越来越广泛。例如，T4DNA连接酶在基因工程中常被用于将目的片段与载体连接，构建新的表达载体；它也可用于连接酶介导的PCR等基因检测技术。但是由于T4DNA连接酶错配区分能力较差，连接特异性低，容易出现假阳性。而热稳定的TaqDNA连接酶，区别错配的能力明显高于T4DNA连接酶，因此Taq　DNA连接酶可更好地应用于检测技术。T4DNA连接酶发现较早，其连接特性已得到了较深入研究，但一般认为TaqDNA连接酶只能连接较长的黏性末端或切口部位，对其连接特性，尤其是短链的连接还很少有报道，因此本研究对其连接特性进行了系统研究，可为开发与DNA连接酶相关的生物技术提供依据。由于Taq　DNA连接酶的连接温度较高（65℃），一般需要足够长的DNA双链（＞22nt）来确保该双链在连接温度下不发生解链，很难研究更高温度（如70℃）的连接特性。另外，使用双链底物时很难保证连接的寡核苷酸片段以1∶1的比例加入。有些短的发卡结构在高温下很稳定，如环区序列为ＧＮＡ或ＧＮＮＡ的发卡结构都非常稳定。而且发卡结构在分子内形成，一条链即可形成连接所需的黏性末端结构，而且茎部只有5～6个碱基（GC含量较高）时，其Tm值就可达到80℃。

链接特性^[1]

为进一步研究TaqDNA连接酶的作用机理、开发以DNA连接作为关键步骤的新生物技术，本文以含有超稳定发卡结构的DNA（带有11nt长的单链部分）和另一条单链DNA为连接底物，研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特性、聚乙二醇（PEG）的添加等对连接的影响，探讨了Taq　DNA连接酶的连接特性。连接结果显示：单链DNA的3’端同发卡结构I底物相连的连接率，比单链DNA的5’端同发卡结构II底物相连的连接率更高；可以连接的最短单链DNA片段的长度为6nt；在20～65℃范围内，一般连接率随温度升高而升高。在连接时，由2条底物通过互补配对形成的复合体的热稳定性对连接率影响不大，一般在连接温度远远高于该复合体的熔点时仍有很高的连接率。在70或75℃时，虽然连接率有所降低，但仍然可以连接9nt的单链DNA片段。研究还发现，在片段连接上，PEG6000对较难连接的片段有促进作用，对容易连接的片段（8～10nt）促进作用不显著，甚至有一定抑制作用。

相关研究^[2]

构建了新型纳米金比色芯片，利用TaqDNA连接酶的连接特异性，将其与乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)靶序列完全互补杂交的捕获探针(固定在芯片上)和纳米金修饰的探针连接成一条链，从而将纳米金颗粒固定到芯片点阵上，再通过银染反应放大，形成裸眼可见的显色信息。通过点阵的位置及灰度，即可判断HBV-DNA靶序列的单碱基突变，并得出相对定量信息。本实验对不同浓度的HBV-DNA靶序列进行了检测。结果显示：此技术对单碱基突变有很强的特异性识别能力，并且具有较高的灵敏度(约10pmol/L)，在10～100pmol/L浓度范围内表现出较好的线性关系。该技术检测时间短(1h)、操作简单、不需要特殊的检测设备，具有很好的临床应用前景。

主要参考资料

[1] Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　DNA连接酶的连接特性研究

[2] 高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒DNA及其变异