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T7核酸外切酶的相关研究

发布日期:2019/4/17 17:12:07

背景及概述[1]

核酸外切酶一种要求有一个游离末端才能降解DNA或RNA的酶。5′-核酸外切酶需要有一个游离的5′端,从5′→3′的方向逐个降解核酸分子;3′-核酸外切酶则需要一个3′游离端,并按相反方向逐个降解核酸分子;而外切核酸酶Ⅲ(ExoⅢ)则是大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)的一个多功能酶,使用最多的酶活性是3′→5′-核酸外切酶的活性,可在dsDNA中造成一个ssDNA区,故可用于Sanger的DNA序列分析法中。

T7核酸外切酶作用于双链DNA,沿5→3方向催化去除5单核苷酸,它既能从5末端起始消化,也能从双链DNA的切刻或缺口处起始消化。它既能降解5磷酸化DNA也能降解5去磷酸化DNA。据报道,它能沿5→3方向降解RNA/DNA杂交双链上的RNA或DNA,但不能降解双链或单链RNA。该酶是T7噬菌体基因6的产物。T7核酸外切酶具体有下列特点:1.5→3核酸外切酶活性2.切下DNA的5单核苷酸。T7核酸外切酶反应条件:1XBuffer4[50mMKAc,20mMTris-Ac,10mMMg(Ac)2,1mMDTT(pH7.9@25℃)],25℃温育。

相关研究[2]

有研究采用不依赖连接反应的克隆法,利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修饰引物克隆Notch2长片段基因。将难以扩增的Notch2cDNA的编码序列(7416bp)人为分成3段,引物设计时对此3个片段和载体骨架的引物进行碱基硫代磷酸化修饰,用这些引物扩增Notch2的3个片段和载体骨架。然后用T7核酸外切酶分别处理PCR产物,产生4个具有3’互补突出末端的片段,并将此4个末端突出的片段退火复性,完成Notch2基因克隆。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示Notch23个片段和载体骨架的PCR产物大小与预期大小相符,经退火复性获得的克隆通过PCR、酶切和测序进行克隆鉴定,确定Notch2编码序列已经插入到pcDNA3.0-3*Flag载体中。因此利用T7核酸外切酶和引物的碱基磷酸化修饰进行的不依赖连接反应的克隆方法能够用于长片段基因的克隆。

主要参考资料

[1] 微生物学词典

[2] 利用T7核酸外切酶和硫代磷酸化修饰引物克隆长片段基因的研究