小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒是一种用于检测小鼠体内新生甲状腺素水平的实验工具。这种试剂盒主要基于酶联免疫吸附法（ELISA）的原理，通过特定的抗体与样本中的NN-T4结合，进而通过一系列反应产生可测量的信号，从而实现对NN-T4的定量检测。

小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒的主要成分包括酶标板、试剂、标准品等，通常以盒装液体的形式提供。实验过程中，需要先将纯化的小鼠新生甲状腺素抗体包被在微孔板上，制成固相抗体。然后，将待测样本加入到微孔中，样本中的NN-T4会与固相抗体结合。接着，加入HRP标记的新生甲状腺素抗体，与已结合的NN-T4形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。经过洗涤去除未结合的成分后，加入底物TMB进行显色反应。TMB在HRP酶的催化下会转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样本中的NN-T4浓度成正比。最后，使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），并通过标准曲线计算样本中NN-T4的浓度。

小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒

小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒操作步骤

实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。

6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。

应用^[4][5]

小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒可以用于下丘脑-垂体-甲状腺轴与儿童脓毒性休克关系研究

通过前瞻性观察性分析脓毒性休克患儿甲状腺激素水平改变,探讨其与疾病预后的关系;探讨左旋甲状腺素钠片在脓毒性休克合并非甲状腺病态综合征(nonthyroidal illness syndrome,NTIS)患儿干预治疗中对疾病预后的影响。

【目的】探讨血液甲状腺激素水平改变与儿童脓毒性休克预后的关系。【方法】前瞻性观察性分析2017年9月至2019年8月上海交通大学附属儿童医院儿童重症监护室(pediatric intensive care unit,PICU)确诊为脓毒性休克患儿的临床资料及甲状腺激素水平。根据患儿出PICU时转归情况分为生存组和死亡组,比较两组患儿小儿死亡风险评分(pediatric risk of mortality III,PRISM III)、血乳酸(lactate,Lac)、血小板(platelet,PLT)及小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒甲状腺激素等指标的变化,分析这些指标与脓毒性休克预后的关系。

【结果】共纳入93例患儿,生存组67例,死亡组26例。脓毒性休克住院病死率为28.0%(26/93)。脓毒性休克患儿入PICU后24h内Fib、PLT、甲状腺素(thyroxine,T4)、游离T3(free 3,5,3’-triiodothyronine,f T3)和小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒游离T4(free T4,f T4)水平在死亡组显著低于生存组(P<0.05),Lac和PRISM III评分在死亡组显著高于生存组(P<0.05)。单因素logistic回归分析发现脓毒性休克合并心力衰竭、脑损伤,PRISM III评分、Lac升高,PLT、Fib、T4、f T3和f T4水平降低与脓毒性休克患儿病死率相关(P值均<0.05);多因素logistic分析显示高Lac及低T4水平是脓毒症预后不良的风险因素(分别为OR:1.319,95%CI:1.097-1.586,P=0.003;OR:0.968,95%CI:0.945-0.991,P=0.008)。

小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒受试者曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析显示血清T4联合Lac水平预测脓毒性休克患儿病死率的曲线下面积(AUC)为0.832,95%CI:0.745-0.920,较单独Lac或单独T4曲线下面积更高,其敏感度为69.2%,特异度为82.1%。根据T4预测脓毒症死亡发生的cutoff值(58.71 nmol/L)分组,T4≥58.71 nmol/L为低危组和T4<58.71 nmol/L为高危组,发现高危组病死率更高(60.0%vs.16.18%,P<0.001),且高危组PRISM III评分、CRP、Lac水平,血管活性药物使用率及CRRT例数均显著高于低危组(P值均<0.05)。小鼠新生甲状腺素(NN-T4)ELISA试剂盒线性相关性分析显示T4水平与PRISM III评分、Lac和CRP呈显著性负相关(分别为r=-0.421,P<0.001;r=-0.299,P=0.003;r=-0.296,P=0.004),与PLT呈显著正相关(r=0.280,P=0.007)。

参考文献

[1]Thyroid Hormone Profile in Children with Sepsis:Does Euthyroid Sick Syndrome Exist?[J]..Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences,2019

[2]Non-Thyroidal Illness Syndrome in Critically Ill Children:Prognostic Value and Impact of Nutritional Management.[J].Jacobs An;;Derese Inge;;Vander Perre Sarah;;van Puffelen Esther;;Verstraete Sören;;Pauwels Lies;;Verbruggen Sascha;;Wouters Pieter;;Langouche Lies;;Garcia Guerra Gonzalo;;Joosten Koen;;Vanhorebeek Ilse;;Van den Berghe Greet.Thyroid:official journal of the American Thyroid Association,2019

[3]Global Case-Fatality Rates in Pediatric Severe Sepsis and Septic Shock:A Systematic Review and Meta-analysis[J].Bobby Tan;;Judith Ju-Ming Wong;;Rehena Sultana;;Janine Cynthia Jia Wen Koh;;Mark Jit;;Yee Hui Mok;;Jan Hau Lee.JAMA Pediatrics,2019

[4]The Value of Decreased Thyroid Hormone for Predicting Mortality in Adult Septic Patients:A Systematic Review and Meta-Analysis.[J].Kim Jae Guk;;Shin Hyungoo;;Kim Wonhee;;Lim Tae Ho;;Jang Bohyoung;;Cho Youngsuk;;Choi Kyu-Sun;;Ahn Chiwon;;Lee Juncheol;;Na Min Kyun.Scientific reports,2018

[5]宋佳.下丘脑-垂体-甲状腺轴与儿童脓毒性休克关系研究[D].上海交通大学,2022.