对OrigamiB(DE3) 感受态细胞的介绍

背景及概述^[1]

大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞(Competent Cells)。OrigamiB(DE3)菌株包含突变的硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase）(trxB) 和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)(gor)基因，表达主要还原途径的两个关键酶，有利于形成正确折叠的含有二硫键的蛋白，增强蛋白的可溶性。 该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区（DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶），可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达，具有卡那霉素和四环素抗性，不能用于具有卡那霉素抗性质粒的表达。OrigamiB (DE3) 感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达10⁸ cfu/μg DNA。

操作方法^[1]

1. Origami B (DE3)感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

基因型^[1]

F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm lacY1 ahpC (DE3) gor522::Tn10 trxB (KanR,TetR)

注意事项^[1]

1. 感受态细胞在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入质粒时应轻柔操作。

3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4. 诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2mM均可)。

5. 为获得需要量的蛋白，诱导时间，温度，IPTG浓度需实验者优化。

主要参考资料

[1] OrigamiB(DE3) 感受态细胞说明书