M15 感受态细胞的应用

背景及概述^[1]

大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA)，处于这种状态的细胞称作感受态细胞(Competent Cells)。M15[pREP4]菌株携带有阻抑质粒pREP4,该质粒高水平的表达lac抑制子,在IPTG诱导前反式抑制蛋白表达。通过卡那霉素抗性筛选可以保持pREP4质粒在菌株中的稳定性。

操作方法^[1]

1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上或室温融化。

2. 每100μl感受态加1ug质粒DNA混匀，依次于冰上静置10分钟、液氮5分钟、37℃ 5分钟、冰浴5分钟。

3. 加入700μl无抗生素的2YT或LB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。

4. 5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的2YT或LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

应用 ^[2-3]

CN201410620945.3公开一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法，该制备方法按照以下步骤实施：提取香蕉果肉的总RNA并进行反转录，利用电子克隆的方法得到香蕉PPO的编码区序列，构建含有PPO的重组质粒pQE?80L-PPO，将获得的重组质粒pQE?80L-PPO加入到大肠杆菌M15感受态细胞中得到香蕉PPO表达菌pQE?80L-PPO/M15；培养并纯化得到香蕉PPO重组蛋白；该方法具有技术简单、成本低、操作快速、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白易于纯化和具有生物学活性。

CN201110208387.6涉及一种鸡干扰素γ的制备复性方法，包括以下步骤：

(1)对鸡干扰素γ基因进行PCR扩增；

(2)将步骤(1)的产物亚克隆到带有6His标记的pET32a表达载体上；

(3)将步骤(2)的产物转化到大肠杆菌M15细胞内；

(4)将步骤(3)的产物进行诱导与表达，然后进行裂解获得表达产物；

(5)将步骤(4)的表达产物纯化；

(6)将纯化后的重组蛋白进行复性处理后得到成品。

本发明使用pET32a和大肠杆菌M15，使鸡干扰素γ基因高效表达的产物纯化后的纯度为95%，高于传统方法的85%，复性后蛋白得率可以达到95ug/ml，高于传统方法的30ug/ml，复性成功率高达38~39%，高于传统方法的20%，制成的总蛋白中有效成分增加，提高了治疗效果，降低了成本。

主要参考资料

[1] M15感受态细胞说明书

[2] CN201410620945.3一种香蕉多酚氧化酶基因、重组蛋白及其制备方法

[3] CN201110208387.6一种鸡干扰素γ的制备复性方法