BJ5183-AD-1感受态细胞的应用

背景及概述^[1]

BJ5183-AD-1是携带了腺病毒质粒pAdeasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一种具有较高重组活力的大肠杆菌菌株，是目前腺病毒系统最常用的感受态细胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC双重突变，赋予BJ5183细胞较强的重组能力，有利于转入的目的基因与腺病毒骨架质粒的重组。endA1（缺失核酸内切酶）的突变有利于重组DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株细胞中已经提前转入了腺病毒质粒pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]，赋予该菌株氨苄抗性，在病毒质粒构建时，只需转入线性化的目的质粒即可，简化了实验步骤，提高了病毒质粒重组概率。Str^R 赋予BJ5183-AD-1菌株链霉素抗性。BJ5183-AD-1感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒(size:1163bp)检测转化效率>1×10⁵ cfu/μg DNA。  

操作方法^[1]

1. BJ5183-AD-1感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的质粒（含有目标基因并线性化），并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700 μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200 rpm复苏60分钟。

4. 5000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

注意事项^[1]

1. 感受态细胞在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。

2. 混入目的DNA时应轻柔操作。

3. BJ5183-AD-1菌株的质粒产量不高。腺病毒构建成功后，可选择在其他大肠杆菌菌株中扩繁，纯化质粒。

4. BJ5183-AD-1感受态细胞对温度敏感，应储存在-80℃超低温冰箱，避免温度波动，温度波动会降低感受态转化效率。

应用^[2-3]

CN201110121306.9提供一种HSP-GP96重组腺病毒载体，是利用基因工程技术，将人GP96基因片段插入p-shuttleCMV穿梭载体后，转化BJ5183-AD-1，筛选正确的重组腺病毒质粒并将其线性化后转染AD293细胞，在AD293细胞内包装并大量扩增纯化获得。本发明利用HSP-GP96重组腺病毒载体感染白血病细胞，获得HSP-GP96白血病肽复合物，从而在制备治疗白血病残留的瘤苗复合物中应用。制备的复合物可应用于消灭白血病微小残留病，有望达到异基因骨髓移植相当的疗效，可节约治疗成本，明显降低医疗费用。

CN200610050324.1涉及一种用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体，步骤是：1)将小鼠脾细胞RNA逆转录成为cDNA后，用聚合酶扩增出IL-18BP，IL-4基因序列，并用直链氨基酸接头构建成IL-18BP与IL-4融合基因；2)将融合基因和穿梭载体pShuttle-CMV质粒用BglII和HindIII双酶切后利用T4DNA连接酶进行连接，获得连接产物PSC-IL-18BP/IL-4；3)将连接产物和对照质粒PSC-LacZ电转化入BJ5183-AD-1感受态细菌中后获得AD-IL-18BP/IL-4和AD-LacZ对照腺病毒载体质粒；4)扩增经鉴定正确的腺病毒载体质粒，用PacI酶切纯化后将质粒转入AD293细胞中，当出现细胞病变效应时，收获细胞及培养上清，收集上清感染AD293细胞。本发明的有益效果是：用此重组腺病毒治疗，可缩短类风湿关节炎病程，抑制关节炎病变，减轻关节炎症程度，发挥抗类风湿关节炎的作用。

主要参考资料

[1] BJ5183-AD-1感受态细胞说明书

[2] CN201110121306.9HSP-GP96重组腺病毒载体及构建和应用

[3] CN200610050324.1用于类风湿关节炎基因治疗的重组腺病毒载体