WESTERN封闭液的应用

背景^[1-3]

WESTERN封闭液也称为Western Blocking Buffer，是蛋白质印迹（Western Blot）实验中用于封闭转移了蛋白样品的PVDF膜或NC膜的一种试剂。其主要目的是减小后续的一抗或二抗与膜的非特异性结合，从而降低背景着色，增强信噪比。

WESTERN封闭液的主要成分通常包括TBS、BSA（牛血清白蛋白）和防腐剂等。其中，BSA经过优化选择，能有效封闭膜上的蛋白结合位点，同时减少后续抗体的非特异性结合。除了使用含有BSA的封闭液外，还有一些实验会使用含脱脂奶粉、明胶或酪蛋白的封闭液，这些成分也具有一定的封闭效果。

WESTERN封闭液的使用通常是在转膜和洗涤步骤之后进行。封闭的时间和温度可以根据实验的具体情况进行调整。对于一些背景较高的抗体，可以选择在4℃条件下封闭过夜。此外，WESTERN封闭液应妥善保存，避免室温放置过久或反复冻融，以免导致蛋白降解和活性丧失。

WESTERN封闭液

Western封闭液是用于Western Blot实验中的一个重要组分，它的主要作用是减少非特异性结合，提高抗体与抗原结合的特异性。

Western Blot是一种常用的蛋白质分析方法，通过聚丙烯酰胺电泳将蛋白样本按分子量大小分离后转移到杂交膜上，然后利用一抗和二抗对靶蛋白进行特异性检测。在这个过程中，封闭液的应用是一个关键步骤，它能够帮助防止抗体在膜上非特异性地结合，这种非特异性结合会导致背景信号增强，从而干扰实验结果的准确性。正确的封闭液选择对于Western Blot实验的成功至关重要。

此外，还有一些Western封闭液，它们被设计用于Western Blot中转移了蛋白样品的PVDF膜或NC膜的封闭。这些封闭液可以有效减小后续的一抗或二抗和膜的非特异性结合，从而提高实验的灵敏度和特异性。

在选择Western封闭液时，需要考虑实验的具体需求，比如膜的类型、样品的特性以及所需的实验灵敏度等。使用封闭液时，应按照产品说明书或实验室的标准操作流程进行，以确保实验结果的可靠性。

应用^[4][5]

WESTERN封闭液可以用于利钠肽受体C在糖尿病性心肌病发病中的作用和分子机制研究

细胞提取和处理实验中采用组织消化和差速贴壁法提取新生大鼠乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞。心肌细胞(cardiomyocytes,CM)培养在含8%马血清和5%新生牛血清的低糖DMEM培养基中。心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF)培养在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中。所有细胞培养在含有5%CO2的37℃培养箱中。分别给予正常糖(normalglucose,NG)组和高糖(highglucose,HG)组的细胞终浓度为5.5 mM和33.3 mM的葡萄糖刺激,并给予高渗(high osmotic,HO)组细胞终浓度为33.3 mM的甘露醇刺激。

细胞主要处理如下:(1)分别给予CF NG、HG和HO刺激并收集细胞;(2)分别给予CF对照小干扰RNA(si-NC)和NPRC小干扰RNA(si-NPRC)转染,随后给予NG和HG刺激,收集细胞;(3)分别给予CM si-NC和si-NPRC转染,随后给予NG和HG刺激,然后用不同处理的CM上清处理CF,收集细胞;(4)分别给予CF si-NC、si-NPRC、si-NPRC+si-TGIF1转染,随后给予HG刺激,收集细胞;(5)分别给予CF对照腺病毒(Ad-GFP)、ANP过表达腺病毒(Ad-ANP)、BNP过表达腺病毒(Ad-BNP)和CNP过表达腺病毒(Ad-CNP)转染并收集细胞;(6)给予CF cAMP/PKA的激活剂forskolin和抑制剂H89处理并收集细胞;(7)给予CF cGMP/PKG的激活剂8-br-cGMP和抑制剂KT5823处理并收集细胞;7.细胞免疫荧光检测对不同处理的细胞爬片行4%多聚甲醛固定、0.1%Triton X-100通透、5%BSA封闭和一抗过夜孵育,次日清洗后孵育二抗,并滴加DAPI染核,应用荧光显微镜检测荧光信号并保存。

细胞增殖检测实验对细胞进行处理后,向细胞培养基中以1:2500的比例滴加EdU溶液,孵育12小时后,对细胞进行固定、通透、染色处理,检测荧光信号并保存。另外,向处理后的细胞培养基中以1:10的比例加入CCK-8溶液,孵育4小时后,于酶标仪上读取450nm处的吸光度(OD值)。免疫共沉淀(CO-IP)实验对细胞进行处理后,用裂解液裂解细胞,分别加入cPML的抗体和对照小鼠IgG孵育1小时,然后加入琼脂糖珠孵育过夜。次日用裂解液清洗琼脂糖珠,随后进行蛋白免疫印迹实验(Western blot)利用裂解液提取细胞蛋白,BCA法测定蛋白浓度后,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后应用半干转法将蛋白转印到膜上。膜经WESTERN封闭液封闭封闭后过夜孵育一抗,次日清洗后孵育二抗,应用化学发光法检测蛋白信号。

细胞质和细胞核蛋白分离提取对细胞进行处理后,利用胞浆和胞核提取缓冲液分别提取细胞质和细胞核蛋白并行Western blot检测。细胞cAMP和cGMP水平检测细胞经处理后,应用Cyclic AMP/GMP化学发光检测试剂盒检测细胞cAMP和cGMP水平,并在酶标仪上读取450 nm的OD值。细胞转录组测序细胞经处理后,用Trizol溶液反复吹打裂解细胞,将裂解液冻存于-80℃后,送往上海鲸舟基因科技有限公司进行转录组测序及分析。RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR(RT-PCR)提取细胞总RNA,测量浓度后进行反转录获得cDNA,然后通过实时荧光PCR获取细胞中NPRA、NPRB、NPRC、TGIF1基因的Ct值,以2-ΔΔCt公式计算基因的相对表达量。蛋白免疫印迹实验(Western blot)利用蛋白提取试剂盒提取小鼠心脏组织蛋白,或利用裂解液提取细胞蛋白,BCA法测定蛋白浓度后,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,之后应用半干转法将蛋白转印到膜上。膜经WESTERN封闭液封闭后过夜孵育一抗,次日清洗后孵育二抗,应用化学发光法检测蛋白信号。

参考文献

[1]IDF diabetes Atlas:Global,regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045.[J].Sun Hong;Saeedi Pouya;Karuranga Suvi;Pinkepank Moritz;Ogurtsova Katherine;Duncan Bruce B;Stein Caroline;Basit Abdul;Chan Juliana C N;Mbanya Jean Claude;Pavkov Meda E;Ramachandaran Ambady;Wild Sarah H;James Steven;Herman William H;Zhang Ping;Bommer Christian;Kuo Shihchen;Boyko Edward J;Magliano Dianna J.Diabetes research and clinical practice,2021

[2]Heart failure in diabetes.[J].Jankauskas Stanislovas S;Kansakar Urna;Varzideh Fahimeh;Wilson Scott;Mone Pasquale;Lombardi Angela;Gambardella Jessica;Santulli Gaetano.Metabolism:clinical and experimental,2021

[3]2021 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure.[J].McDonagh Theresa A;Metra Marco;Adamo Marianna;Gardner Roy S;Baumbach Andreas;Böhm Michael;Burri Haran;Butler Javed;ČelutkienėJelena;Chioncel Ovidiu;Cleland John G F;Coats Andrew J S;CrespoLeiro Maria G;Farmakis Dimitrios;Gilard Martine;Heymans Stephane;Hoes Arno W;Jaarsma Tiny;Jankowska Ewa A;Lainscak Mitja;Lam Carolyn S P;Lyon Alexander R;McMurray John J V;Mebazaa Alex;Mindham Richard;Muneretto Claudio;Francesco Piepoli Massimo;Price Susanna;Rosano Giuseppe M C;Ruschitzka Frank;Kathrine Skibelund Anne.European heart journal,2021

[4]PSPC1 is a new contextual determinant of aberrant subcellular translocation of oncogenes in tumor progression.[J].Lang YawDong;Jou YuhShan.Journal of biomedical science,2021

[5]孟霖霖.利钠肽受体C在糖尿病性心肌病发病中的作用和分子机制研究[D].山东大学,2024.