TOP10感受态细胞的应用

背景^[1-3]

TOP10感受态细胞是一种经过特殊处理的细胞，具有高效转化外源DNA的能力。这种细胞被广泛应用于分子生物学和遗传工程领域，用于转化和表达外源基因。

TOP10感受态细胞的主要特点包括高转化效率、稳定性好以及基因突变少。这使得它成为处理难以转化的DNA质粒的理想选择。相比其他常见的感受态细胞，如DH5α，TOP10在某些方面可能具有优势。

制备TOP10感受态细胞的过程通常涉及使用理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。这通常包括处理细胞以提高其通透性，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。

在使用TOP10感受态细胞进行转化实验时，需要向感受态细胞悬液中加入需转化的目的DNA。然后，通过一系列的温度变化和处理步骤，如冰浴、热激和复苏培养，促进DNA进入细胞并进行表达。

TOP10感受态细胞

TOP10感受态细胞是一种高效、稳定的工具，用于在实验室中进行基因转化和表达研究。然而，具体的应用和效果可能因实验条件和目的的不同而有所差异。因此，在使用TOP10感受态细胞时，建议参考相关的实验手册和文献，以确保实验的准确性和可靠性。

制备和使用TOP10感受态细胞的操作步骤主要包括以下几个关键步骤：

制备TOP10感受态细胞：

1.取适量TOP10菌液，接种至含适当营养物质的液体培养基中，并在适宜的温度和摇床速度下培养至对数生长期。

2.收集对数生长期的菌液，进行洗涤和离心，以去除培养基和其他杂质。

3.使用特定的化学试剂（如氯化钙）处理细胞，使其转变为感受态状态，此时细胞易于接受外源DNA。

4.将制备好的感受态细胞保存在适当的条件下，以备后续使用。

5.取适量制备好的TOP10感受态细胞，加入需转化的外源DNA（如质粒）。

6.在冰上静置一段时间，使DNA与感受态细胞充分接触。

7.进行热激处理，一般是在42℃水浴中短暂加热，以促使DNA进入细胞。

8.热激后立即将细胞置于冰上冷却，并加入营养丰富的培养基进行复苏培养，使细胞恢复正常生长状态。

9.将复苏培养后的菌液涂布于含有适当抗生素的固体培养基上，进行培养。

10.观察培养基上的菌落生长情况，挑选出可能含有转化DNA的菌落。

11.对挑选出的菌落进行进一步鉴定，如PCR扩增、测序等，以确认是否成功转化了所需的外源DNA。

应用^[4-5]

TOP10感受态细胞可以用于表达H9N2禽流感病毒HA2蛋白重组乳酸菌的构建与免疫效果研究

将H9N2 AIV的主要保护性抗原HA2分别导入乳酸菌组成型表达系统和诱导型表达系统,构建了两株表达H9N2 AIV HA2蛋白的重组乳酸菌,旨在开发能够防控H9N2 AIV的新型制剂。研究内容及结果如下:1.表达H9N2 AIV HA2蛋白重组乳酸杆菌和重组乳酸乳球菌的构建:对H9N2 AIV流行毒株提取RNA,反转录为c DNA,扩增HA2全基因,连接至p MD18-T质粒,热激转化到DH5α感受态细胞,构建出克隆质粒p MD18-T-HA2。选择NcoⅠ和HindⅢ双酶切p32-p SIP409质粒,将线性化载体p32-p SIP409和基因片段HA2通过同源重组酶连接,热激转化至TOP10感受态细胞,提取质粒,电转化入植物乳杆菌NC8感受态细胞,利用红霉素抗性筛选阳性菌株。提取质粒测序验证,含正确重组质粒的菌株命名为p32-p SIP409-HA2/NC8。重组菌株30℃静置过夜自发表达,经SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白特异性,结果显示重组植物乳杆菌p32-p SIP409-HA2/NC8成功表达27 k Da HA2蛋白。选择NcoⅠ和KpnΙ同时双酶切HA2基因片段和p NZ8149质粒,通过T4 DNA连接酶进行连接,电转化入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞,利用Elliker培养基筛选阳性菌株。提取质粒测序验证,含正确重组质粒的菌株命名为p NZ8149-HA2/NZ3900。通过Nisin对重组菌株进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白特异性,结果显示重组乳酸乳球菌p NZ3900-HA2/NZ3900成功表达27k Da HA2蛋白。

参考文献

[1]Infectious Bronchitis Virus Infection Increases Pathogenicity of H9N2 Avian Influenza Virus by Inducing Severe Inflammatory Response[J].Kong Lingchen;You Renrong;Zhang Dianchen;Yuan Qingli;Xiang Bin;Liang Jianpeng;Lin Qiuyan;Ding Chan;Liao Ming;Chen Libin;Ren Tao.Frontiers in Veterinary Science,2022

[2]Generation and evaluation of a recombinant goose origin Newcastle disease virus expressing Cap protein of goose origin avastrovirus as a bivalent vaccine in goslings[J].Xu;;Li;;Liu;;Chen;;Jia.Poultry Science,2019

[3]Avian Influenza A Virus Infection among Workers at Live Poultry Markets,China,2013-2016.[J].Ma Mai-Juan;;Zhao Teng;;Chen Shan-Hui;;Xia Xian;;Yang Xiao-Xian;;Wang Guo-Lin;;Fang Li-Qun;;Ma Guan-Yuan;;Wu Meng-Na;;Qian Yan-Hua;;Dean Natalie E;;Yang Yang;;Lu Bing;;Cao Wu-Chun.Emerging infectious diseases,2018

[4]Influenza.[J].Krammer Florian;;Smith Gavin J D;;Fouchier Ron A M;;Peiris Malik;;Kedzierska Katherine;;Doherty Peter C;;Palese Peter;;Shaw Megan L;;Treanor John;;Webster Robert G;;García-Sastre Adolfo.Nature reviews.Disease primers,2018

[5]李雨欣.表达H9N2禽流感病毒HA2蛋白重组乳酸菌的构建与免疫效果研究[D].山东农业大学,2024.