绿色荧光蛋白的应用

背景^[1-3]

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种天然存在的蛋白质，具有荧光特性。它最早由下村修等人在1962年从维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）中发现。这种蛋白质在蓝光到紫外线的激发下，能够发出绿色荧光。在发光过程中，还需要冷光蛋白质（如Aequorin）的帮助，这种冷光蛋白质与钙离子可以产生交互作用。

绿色荧光蛋白具有多个重要性质，包括自发荧光、多态性、稳定性和高亮度。由于这些特性，它在分子生物学和细胞生物学领域得到了广泛的应用。例如，通过融合绿色荧光蛋白与其他蛋白质或染色体，可以实现对细胞、组织和生物体内特定成分的可视化。此外，作为一种报告分子，它在检测蛋白表达、蛋白和细胞荧光示踪、研究蛋白质之间相互作用和构象变化等方面也发挥了重要作用。

绿色荧光蛋白

绿色荧光蛋白（GFP）是一种能够在光照下发出绿色荧光的蛋白质，广泛应用于生物医学研究。

结构特点：GFP由约238个氨基酸组成，其发光机理是由特定的三肽形成的发光团所决定的。

激发光源：它可以被蓝光到紫外线范围内的光线激发，从而发出明亮的绿色荧光。

应用广泛：在生物学研究中，GFP作为一种无毒、可以在活细胞中表达的荧光蛋白，被用于标记基因表达、细胞融合、转录活动以及共振能量转移等过程。

优点显著：它具有快速、空间精确、稳定性和明亮度等优点，这使得它成为分子和细胞生物学研究中不可或缺的工具。

变种丰富：通过对GFP进行突变，科学家们已经开发出了多种具有不同光谱特性的荧光蛋白，如红色荧光蛋白等。

发现历史：绿色荧光蛋白是最早被发现并应用于科学研究的荧光蛋白之一，最初是从维多利亚多管水母中提取的。

其他颜色的荧光蛋白：除了绿色荧光蛋白，还有从其他海洋生物中提取的不同颜色的荧光蛋白，如从珊瑚Discosoma genus中提取的红色荧光蛋白等。

近年来，科研人员对绿色荧光蛋白进行了进一步的优化和改造，例如开发出了亮度更高、光稳定性更强的变体，以及适用于特定研究需求的特殊类型绿色荧光蛋白。这些改进使得绿色荧光蛋白在生物学研究中具有更广泛的应用前景。

应用^[4-5]

绿色荧光蛋白可以用于hESC衍生和组织来源间充质干细胞慢病毒转导GFP基因的特性分析

目的:1.用pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪分析慢病毒对三种不同来源人间充质干细胞的转导效率。2.将成功标记绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续传代培养,分析传代培养对绿色荧光蛋白基因阳性的细胞形态及荧光表达的影响。3.测定荧光蛋白标记前后的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖、分化及细胞表型,分析慢病毒介导的绿色荧光蛋白转导对人间充质干细胞增殖、分化及细胞表型的影响,为后续干细胞体内示踪奠定基础。

方法:1.用相同MOI值pLVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测三种不同来源人间充质干细胞的慢病毒转导效率。

2. 将标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养传代,观察细胞形态的变化和绿色荧光蛋白基因的表达,流式细胞仪检测细胞增殖10代后绿色荧光蛋白阳性细胞的比例。

3. 对绿色荧光蛋白标记前后的细胞用CCK-8法测定细胞增殖情况,用定向诱导分化培养液进行成脂、成骨、成软骨诱导分化,油红O、茜素红、阿利新蓝染色液分别对分化后的细胞染色,流式细胞仪测定标记前后细胞表面抗原CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR的表达。

结果:1.p LVX-IRES-Puro-GFP慢病毒转导人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的效率存在明显差异,且差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结果显示,人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞慢病毒转导效率最高,其次是人脐带间充质干细胞,人脂肪间充质干细胞转导效率最低。

2. 标记有绿色荧光蛋白基因的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞继续培养繁殖10代,倒置荧光显微镜下仍然可见几乎所有细胞均带有绿色荧光。自然光线下可见细胞贴壁成梭形,胞质丰富,细胞整体成漩涡状生长,均保持了正常良好的细胞形态,与同代数未转导干细胞比较无明显差异。

3.标记有绿色荧光蛋白的人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞的增殖曲线和未标记细胞相近,在450nm波长下测得的OD值无统计学差异(P>0.05),人胚胎干细胞衍生的间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞标记绿色荧光蛋白基因后依然能分化成脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,流式细胞仪测定表面抗原CD73、CD90、CD105阳性比例均在95%以上,CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR几乎不表达(<0.2%)。与同代数未转导干细胞表面抗原表达结果一致。

参考文献

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