人胎儿真皮成纤维细胞的纯度鉴定

背景及概述^[1]

成纤维细胞是疏松结缔组织中最常见而且数量较多的一种细胞，位于胶原纤维近旁并依附于其上。此细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。在功能活动旺盛时，成纤维细胞的胞体较大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圆形，核染色质较少，着色浅，核仁明显。胞质较多，弱硷性，内含丰富的粗面内质网、核蛋白体、高尔基复合体以及微丝和微管等结构，表明此种细胞具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和多糖蛋白，形成胶原纤维、弹性纤维、网状纤维和基质的作用。在相对静止或功能活动不活跃时的细胞，称为纤维细胞。这种细胞比成纤维细胞小，轮廓不甚清楚，多呈梭形。胞质少，弱嗜酸性，其中粗面内质网、高尔基复合体及其它细胞器均不发达。这表明纤维细胞是功能活动不活跃的细胞。但在一定条件下，如创伤修复，结缔组织再生时，纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞，积极参与合成和分泌蛋白质，形成纤维和基质。人胎儿真皮成纤维细胞分离自胎儿真皮组织，呈长梭形。该细胞主要分布于黏膜和皮下疏松结缔组织，胞质内富含嗜碱性颗粒，细胞表面能够表达高亲和力FcεRI，可结合游离IgE，参与I型超敏反应。人胎儿真皮成纤维细胞冻存细胞时必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有DMSO或者甘油等冷冻保护剂。还可使用专门配制的完全冻存培养基。

培养方法^[2]

将皮肤组织剪成细小碎块，0.25%胰蛋白酶消化6min，加入10%FBS和1万U/L青霉素、链霉素的RPMR1640完全培养基中，放人含5%二氧化碳、37℃孵箱中培养。12小时后更换培养液，以后每三四天更换1次完全培养液。当细胞长成梭形，融合至约70%时，将细胞用胰蛋白酶消化传代。

纯度鉴定^[2]

室温下45多聚甲醛固定细胞3min，含5%牛血清白蛋白的洗2次，固定细胞在1：100鼠抗人成纤维细胞抗体中，4℃孵育16小时。鼠IgG代替一抗作为阴性对照。用PBS将细胞洗3次，加人1：100抗鼠一室温下孵育60min。PBS洗3次，每次5min。抗荧光衰减剂封片，在荧光显微镜下观察，并与同视野下光镜对照。

随机选取5个视野，分别计数荧光阳性细胞数和明场总细胞数的比值，作为纯度指标。

主要参考资料

[1] 运动解剖学、运动医学大辞典

[2] 蛋白酶活化受体在胎儿真皮成纤维细胞上的表达