HOECHST33258染色液的应用

背景^[1-3]

HOECHST33258染色液是一种细胞核染色试剂，也是一种蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。它可以穿透细胞膜，与DNA结合，主要用于细胞核或常规的DNA染色，尤其在细胞凋亡检测中非常有用。HOECHST33258染色液的最大激发波长是346nm，最大发射波长为460nm。

在使用HOECHST33258染色液时，通常的步骤包括细胞爬片或组织切片，用PBS清洗，加入染色液避光孵育，再次用PBS清洗，然后用防荧光淬灭封片剂封片，最后在荧光显微镜下观察或拍照。使用完毕后，染色液应存放在-20℃并避光保存。

HOECHST33258染色液

HOECHST33258染色液的使用步骤如下：

1.对于固定的细胞或组织样品，首先进行适当洗涤以去除固定剂。如果需要进行免疫荧光染色，则先进行免疫荧光染色，染色完毕后再按后续步骤进行HOECHST33258染色。

2.在贴壁细胞或组织切片上，加入适量的HOECHST33258染色液。注意，该染色液是一种非嵌入性荧光染料，可以在活细胞或固定细胞的DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合，从而使细胞核着色。

3.在室温下避光染色一段时间，通常为10~15分钟。染色时间可以根据具体实验需求进行调整。

4.染色结束后，用PBS或其他适当的缓冲液洗涤细胞或组织，以去除多余的染色液。

5.使用抗荧光淬灭封片液封片，以防止荧光淬灭。

6.将样本置于荧光显微镜下观察，激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。此时，细胞核应呈现亮蓝色荧光。

请注意，HOECHST33258染色液是有害物质，使用时需要做好防护，如带手套、口罩，穿实验服。同时，荧光容易淬灭，所以推荐使用防荧光淬灭封片剂封片，并在避光4℃下保存。另外，为确保结果的准确性，建议即时拍照保存结果。

应用^[4-5]

HOECHST33258可以用于蒸制轮叶党参的化学成分分析及药理活性研究

通过对鲜轮叶党参洗净、去皮,高压灭菌蒸汽锅105℃蒸1h,室温下(25℃)干燥,得到蒸制轮叶党参(steamed Codonopsis lanceolata,SCL),SCL粉末用10倍体积甲醇40℃提取90min,提取3次,所得滤液用旋转蒸发仪浓缩,得到SCL粗提液,作为后期实验的样品及药品使用;通过HPLC和LC/MS分析了蒸制轮叶党参中的化学成分,检测到其含有党参炔苷及六种皂苷等成分,为其日后开发成药品打下基础。

本文通过建立H22肝癌移植瘤模型,观察SCL粗提液的体内抗肿瘤作用。结果表明:SCL给药组(200和400mg/Kg)能不同程度的抑制小鼠荷瘤的生长而且能够延长H22荷瘤小鼠的生存时间,增加脏器指数,提高血清中干扰素-γ(IFN-γ),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素-6(IL-6)和白介素-2(IL-2)的水平,降低VEGF的水平,无明显毒副作用;此外,H&E和HOECHST33258染色结果表明:SCL能明显诱导H22肝癌细胞凋亡;免疫组化分析表明:SCL治疗组能增强肿瘤组织中Bax的表达、降低Bcl-2和VEGF的蛋白表达水平,且呈剂量依赖关系。以上结果表明:SCL抗肿瘤机制至少部分是通过抑制H22肿瘤生长和诱导肝癌细胞的凋亡来实现的,且400mg/Kg剂量组表现出显著效果,说明SCL对H22荷瘤小鼠肿瘤有抑制作用,具有较强的体内抗肿瘤活性。

此外,通过建立顺铂诱导的急性肾损伤模型,观察SCL的肾保护活性。结果表明:SCL能够降低小鼠血清中肌酐(CRE),尿素氮(BUN),炎症因子(TNF-α),白介素1β(IL-1β)的水平和肾组织中丙二醛(MDA)的含量;H&E和HOECHST33258染色说明SCL能够抑制细胞凋亡;免疫组化结果显示SCL各剂量给药组均在不同程度上降低了Bax的表达,并且升高了Bcl-2的表达,且呈现一定的剂量依赖性关系。这说明SCL对顺铂所致的急性肾损伤具有保护作用。我们还建立了急性酒精性肝损伤模型,观察SCL对肝损伤的保护作用。

结果显示:SCL有效地降低肝组织中ALT,AST和GSH的含量及血清中TG的水平;且能够显著性升高肝组织中MDA的含量;组织学分析表明SCL能够减弱酒精所致的肝损伤,总体结果说明SCL对急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用。最后,对SCL主要活性物质——紫丁香苷(Syringin)对顺铂致急性肾损伤的保护作用进行研究。HOECHST33258染色液染色结果表明:Syringin能够显著降低小鼠血清中肌酐(CRE),尿素氮(BUN),炎症因子(TNF-α),白介素1β(IL-1β)和肾组织中超氧化物岐化酶(SOD),谷胱甘肽(GSH),过氧化氢酶(CAT)的含量;H&E,HOECHST33258及过碘酸-雪夫染色液(AB-PAS)染色结果表明:Syringin能够改善顺铂造成的肾损伤;免疫组化结果表明:Syringin能够降低Bax和Caspase-3的表达,并且升高Bcl-2的表达,上述结果表明紫丁香苷(Syringin)对顺铂所致的小鼠急性肾损伤具有保护作用。

参考文献

[1]Hydroxysafflor yellow A inhibits angiogenesis of hepatocellular carcinoma via blocking ERK/MAPK and NF-κB signaling pathway in H22 tumor-bearing mice[J].Fangfang Yang;;Jingmin Li;;Jinhui Zhu;;Dong Wang;;Shaoshui Chen;;Xianyong Bai.European Journal of Pharmacology,2015

[2]Total saponins from Albizia julibrissin inhibit vascular endothelialgrowth factor-mediated angiogenesis in vitro and in vivo[J].Weiwei Cai;;Yue Li;;Qingqing Yi;;Fengshan Xie;;Bin Du;;Lei Feng;;Liying Qiu.Molecular Medicine Reports,2015(5)

[3]In-vitro Characterization and Evaluation of Apoptotic Potential of Bicistronic Plasmid Encoding HN Gene of Newcastle Disease Virus and Human TNF-α[J].R.S.Rajmani;;PrafullKumar Singh;;G.Ravi Kumar;;Shikha Saxena;;LakshyaVeer Singh;;Rajiv Kumar;;AdityaP.Sahoo;;ShishirKumar Gupta;;Uttara Chaturvedi;;AshokK.Tiwari.Animal Biotechnology,2015(2)

[4]Anti-hepatoma activity and mechanism of corn silk polysaccharides in H22 tumor-bearing mice[J].Jingyue Yang;;Xiao Li;;Yan Xue;;Nan Wang;;Wenchao Liu.International Journal of Biological Macromolecules,2014

[5]徐颀.蒸制轮叶党参的化学成分分析及药理活性研究[D].吉林农业大学,2017.