单碱基编辑的原理与应用

背景及概述^[1-2]

基因组编辑(简称为基因编辑)技术是利用人工核酸酶对基因组进行靶向修饰的遗传工程技术，是当今生命科学领域的研究热点。CRISPR/Cas9基因编辑系统虽然提高了基因敲除及定点修饰(包括定点突变及基因插入等)的效率，但是基于同源重组机制的基因定点突变效率仍然偏低。为了提高定点突变的效率，一项结合CRISPR/Cas9和胞嘧啶脱氨酶的单碱基编辑系统被相继报道。利用该系统可以在不产生双链DNA断裂的情况下，利用sgRNA将Cas9-胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成的融合蛋白靶向与gRNA(sgRNA中与目标DNA互补配对的序列)互补配对的靶位点，并将该靶位点的胞嘧啶(C)的氨基去除，从而使得C变成尿嘧啶(U)，随着DNA的复制，U又会被胸腺嘧啶(T)替代，最终实现单碱基C→T的精确、高效突变。单碱基编辑技术为基因编辑技术的研究和应用增添了一种重要的工具。

原理^[2]

单碱基编辑法可以精确地、不可逆地实现从一种碱基对到另一种碱基对的转变，而无需DSB或HDR。最初的碱基编辑器是用一个单链DNA特异性胞苷脱氨酶结合一个失活的Cas9(dCas9)，在靶区域使胞嘧啶(C)•鸟嘌呤(G)碱基对转变为胸腺嘧啶(T)•腺嘌呤(A)。脱氨酶-Cas9复合体利用Cas9：guideRNA：DNA三元复合体的R环中的一小段单链DNA，在靶序列的很小的窗口（约3至5个核苷酸）内催化胞嘧啶脱氨转化为尿苷。通过融合褐家鼠APOBEC1胞苷脱氨酶、化脓性链球菌Cas9n(D10A)和枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2UGI，生成了碱基编辑器-BE3。

BE3可形成C•G到T•A的永久性转变，有比HDR更高的编辑效率（15-75%vs<5%），插入突变率（低于5%）比Cas9基因编辑方法更低。除此之外，多项研究表明BE3比Cas9拥有更低的脱靶率。为了进一步降低非特异性的突变，将BE3和高保真的SpCas9(HF-Cas9)相结合，降低了BE3和非目标位点的亲和力，从而创造出了拥有更低脱靶率的HF-BE3。然而，它同时也降低了目标位点的编辑率。为了实现单碱基编辑的可调控性，研究人员设计了一种可以调控的碱基编辑器，将催化自我切割的RNA酶加入guideRNA，只有当配体和它结合的时候，guideRNA才发挥作用。虽然该体系在没有配体的情况下，仍表现出一定的活性，但是其效率比标准的guideRNA低很多，这就使得碱基编辑受控于配体。其它活性诱导的方法，如借助光遗传学，将光敏感小分子结合到碱基编辑器上，使得基因编辑可以得到调控。除了BE3，还有多种方法来解决DSBs的固有局限。Target-AID是一种类似BE3的碱基编辑器，它使用了可选择的结构域和脱氨酶，从而使C•G到T•A的转变过程中有一个可变的脱氨基作用区域。另外，通过改变PAM序列获得了碱基编辑能力更强的BE3变异体，将可编辑的潜在基因库增加了2.5倍，拥有更高的灵敏度和更低的脱靶率。

应用^[1]

1.单碱基编辑系统在人类疾病治疗方面的应用

来自上海交通大学的常兴组率先开发了dCas9-AIDx碱基编辑系统，并将其应用到肿瘤研究中。在肿瘤疾病治疗过程中，基因上特定位点的碱基突变会使部分肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生耐药性，如在慢性髓系白血病(chronicmyloidleukemia，CML)的治疗中，常使用伊马替尼药物来抑制癌细胞中BCRABL激酶的活性，从而抑制白细胞的过度增殖。

但是，在治疗过程中，癌细胞会在特定基因序列点突变(如常见的T315I突变)后产生耐药性，这是目前肿瘤治疗的一大障碍。针对这个问题，常兴组在CML患者来源的K562细胞系中表达了dCas9-hAIDx的融合蛋白，由于没有使用UGI，因此AIDx修饰的胞嘧啶C及互补的鸟嘌呤A可以随机地向其它三种碱基转变。他们使用sgRNA文库将dCas9-AIDx靶向到ABL基因的第6个外显子，诱导点突变的发生。通过用伊马替尼药物筛选，将伊马替尼耐药的细胞与筛选前细胞的ABL的第6个外显子进行深度测序分析，发现了10个与伊马替尼耐药相关的基因突变位点，包括了在临床中已被证实的T315I突变。该研究证明，可以利用此系统筛选肿瘤细胞产生耐药性的突变，探究肿瘤疾病的耐药机制，开创了筛选肿瘤耐药突变的新方法，结合第二代测序技术在临床中的应用，将有助于癌症病人耐药的早期发现，提高癌症病人的生存率。

2. 单碱基编辑系统在动物模型方面的应用

目前，大多数关于单碱基编辑系统的研究报告主要基于细胞实验，而其在动物模型开发中的应用将有利于研究人员深入研究疾病发生和发展的机理。韩国首尔大学Jin-SooKim组率先发表了将rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI(BE3)系统运用于小鼠疾病模型制备的研究成果。针对小鼠的抗肌萎缩蛋白基因Dmd以及酪氨酸酶基因Tyr，分别设计了特异识别的sgRNA，显微注射sgRNA和rAPOBEC1-XTEN -Cas9n-UGI融合蛋白的mRNA或者电转染sgRNA和rAPOBEC1-Cas9n-UGI蛋白的复合物到小鼠受精卵。

在所获得的9只Dmd的F0代小鼠中，有5只小鼠产生了靶位点的碱基突变，包括一只纯合子突变小鼠(CAG＞TAG)。进一步通过免疫染色发现，在这只纯合子Dmd突变小鼠体内几乎检测不到该蛋白的表达。而通过电转染gRNA和rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI融合蛋白的复合物，产生了7只TyrF0后代小鼠中均检测到靶基因突变，包括3只纯合子Tyr突变小鼠。

与Jin-SooKim的发现类似，黄军就组也发现了碱基编辑系统会在胚胎中产生碱基的缺失，并首次报道了在小鼠胚胎中由碱基编辑系统诱导产生的靶位点处的碱基插入以及临近位点的脱氨基。由于所用的dCas9-HF2不具有核酸酶活性，他们认为，碱基的插入和缺失是由于胞嘧啶脱氨基后产生的U被碱基切除修复机制识别，并被切除从而产生无碱基位点，无碱基位点再进一步转化成DNA双链损伤，从而导致碱基插入和缺失的产生。以上两项研究结果充分证明了单碱基编辑系统能高效地用于制备疾病动物模型，但仍需进一步优化来提高特异性及降低碱基插入和缺失的产生。

3. 单碱基编辑系统在植物方面的应用

转基因技术在改良作物性状方面已经做了大量的工作，但由于外源基因的导入和公众科普的缺乏，使得转基因作物的推广和应用存在较大难度。作物在漫长的人工选育过程中，人类通过人工选择的方式定向选育具有优良性状的基因突变株，但该过程耗时耗力且不可控。利用同源重组技术，可以获得定点修饰的优良植物株，但由于同源重组的效率太低，因此可行性不高。单碱基编辑技术在人细胞中高效编辑单个碱基的结果提示，可以通过该系统在农作物中的进行定点可控的基因编辑，进而快速、高效地获得优良性状的植株。

研究还发现在作物中胞嘧啶核苷脱氨酶的作用活性窗口为7个核苷酸序列，从距离PAM最远端数起的第3～9位核苷酸，这相对于在动物细胞中的编辑窗口更广。尝试采用土壤杆菌为载体，携带Cas9n-XTEN-rAPOBEC1-UGI融合蛋白和sgRNA，编辑水稻内一种衰老控制基因OsCDC48。研究结果显示，单碱基编辑效率在5.0%～32.5%，靶位点处没有发现核苷酸序列的随机插入或缺失，而且预测可能的脱靶位点处也没有发现突变。同一时间，中科院上海生命科学研究院的朱健康团队和中国农业科学院作物研究所的夏兰琴团队也分别报道了运用单碱基编辑系统对水稻基因进行单碱编辑。这三个独立的研究表明，单碱基编辑系统可以在农作物中取得高效的编辑效率，为改良作物品种带来新希望。最近，美国农业部官方宣布基因编辑的部分玉米、土豆和黄豆新种是非转基因产品，不受转基因法规监管。因此，我国需要加大对基因编辑技术育种的支持力度，这将会使我国在育种领域获得国际领先的地位。

主要参考资料

[1] 单碱基编辑系统的研究进展

[2] 单碱基编辑工具及在基因治疗中的应用及前景