MHCC-97L人低转移肝癌细胞的应用

背景^[1-3]

MHCC-97L人低转移肝癌细胞是一种人低转移肝癌细胞系，来源于中山医院。这种细胞系具有贴壁上皮样的生长特性，生长速度较慢。其细胞形态为上皮细胞样，细胞代数一般在10代以内。

在细胞培养中，MHCC-97L细胞需要使用特定的培养基，通常是含有90%DMEM和10%FBS（胎牛血清）的培养基，同时还需要添加PS（青霉素-链霉素）以防止细菌感染。细胞传代时，一般使用胰酶进行消化，传代比例为1:2-1:4，具体取决于细胞生长速度和密度。

MHCC-97L人低转移肝癌细胞系具有一定的科研价值，可以用于研究肝癌的发病机制、药物筛选以及肝癌治疗等方面的研究。同时，该细胞系也可以作为一种实验工具，用于评估不同治疗策略对肝癌细胞的影响和效果。

在使用MHCC-97L人低转移肝癌细胞系时，需要注意细胞的培养条件、传代方法和细胞保存等方面的问题，以确保细胞的生长状态和实验结果的准确性。此外，还需要遵守相关的实验室安全规定和操作规程，以保证科研人员的人身安全和实验室的正常运行。

MHCC-97L人低转移肝癌细胞

MHCC-97L人低转移肝癌细胞系培养操作

1)复苏MHCC-97L人低转移肝癌细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)MHCC-97L人低转移肝癌细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)MHCC-97L人低转移肝癌细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

MHCC-97L人低转移肝癌细胞可以用于慢病毒介导的STAT1基因过表达和STAT1基因沉默在肝癌MHCC97L细胞中的应用

探索慢病毒载体介导下STAT1基因在肝癌MHCC97L细胞中过表达和STAT1基因沉默后在MHCC97L细胞中表达量的变化及其分子生物学机制,从而探明STAT1基因是否为影响肝癌细胞生物学效应的靶向基因。

研究方法：①根据人类STAT1基因的mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建过表达载体,然后转化至感受态DH5α细胞进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装产生慢病毒,再将慢病毒载体转染至MHCC-97L人低转移肝癌细胞系,荧光定量PCR及Westernblot检测MHCC97L原始细胞株、MHCC97L-statl稳转细胞株中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。

②设计shRNA干扰序列3对及对照序列1对,构建3个shRNA干扰慢病毒载体,并转化至感受态细胞DH5α行测序验证。脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,侵染MHCC-97L人低转移肝癌细胞系,荧光定量PCR及Western blot检测MHCC-97L人低转移肝癌细胞系、MHCC97-statl过表达细胞株、MHCC97-shSTATl干扰细胞株中STAT1的表达情况,明确STAT1干扰的可行性。

研究结果：STAT1基因过表达研究结果：①STAT1基因合成：通过人类基因组数据库STAT1mRNA序列,全基因合成STAT1基因(CDS区域序列)并基因测序验证成功；②过表达慢病毒颗粒的包装：脂质体介导下转染293T细胞成功,慢病毒侵染MHCC97L细胞,24h后荧光及可见光显微镜下观察细胞,可见大部分细胞发出荧光,侵染成功；③PCR法检测STAT1基因的表达：侵染48h后,相对于原始MHCC-97L人低转移肝癌细胞系,稳转细胞株MHCC97-statl的STAT1基因表达量提高了10938倍,差异具有统计学意义(P<0.01),说明过表达慢病毒STAT1基因对MHCC-97L人低转移肝癌细胞系的侵染率大于90%；④Western blot法检测STAT1基因过表达：稳转细胞株MHCC97-statl的STAT1基因的蛋白条带较原始MHCC97L细胞明显增粗。

STAT1基因干扰沉默研究结果：①干扰慢病毒载体的构建和鉴定：shRNA干扰序列3对,另有对照序列1对连接入pLKO-1-EGFP-puro并基因测序验证成功；②干扰慢病毒颗粒的包装：脂质体介导下转染293T细胞成功,慢病毒侵染MHCC97L-STAT1细胞,24h后荧光及可见光显微镜下观察细胞,可见大部分细胞发出荧光,侵染成功；③PCR法检测STAT1基因的表达：侵染48h后,相对于原始MHCC-97L人低转移肝癌细胞系,pLKO-1-statl-shRNA-1和pLKO-1-statl-shRNA-2的干扰效果比较好,各自的干扰效率为81.4%和72.1%,差异具有统计学意义(P<0.05),说明干扰慢病毒STAT1基因对MHCC-97L人低转移肝癌细胞系干扰效果较好；④Western blot法检测STAT1基因沉默后的表达：稳转干扰细胞株MHCC97-shSTATl的STAT1基因的蛋白条带较原始MHCC-97L人低转移肝癌细胞系、过表达STAT1的稳转细胞明显减少。

参考文献

[1]Prophylactic naked DNA vaccination with the human vascular endothelial growth factor induces an anti-tumor response in C57Bl/6 mice[J].Mónica Bequet-Romero;;Marta Ayala;;Boris E.Acevedo;;Ernesto Galbán Rodríguez;;Omar López Ocejo;;Isis Torrens;;Jorge V.Gavilondo.Angiogenesis,2007(1)

[2]Hepatocellular Carcinoma:Epidemiology,Risk Factors,and Screening[J].Morris Sherman.Semin Liver Dis,2005(02)

[3]Anesthesia induced retrograde amnesia is ameliorated by ephrinA5-IgG in mice:EphA receptor tyrosine kinases are involved in mammalian memory[J].Robert Gerlai;;Alexander McNamara.Behavioural Brain Research,2000(2)

[4]Systemic Spread of Sequence-Specific Transgene RNA Degradation in Plants Is Initiated by Localized Introduction of Ectopic Promoterless DNA[J].Olivier Voinnet;;Philippe Vain;;Susan Angell;;David C Baulcombe.Cell,1998(2)

[5]高翔.慢病毒介导的STAT1基因过表达和STAT1基因沉默在肝癌MHCC97L细胞中的应用[D].北京中医药大学,2014.