脐动脉平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

脐动脉平滑肌细胞是指从脐带动脉中分离出来的平滑肌细胞。平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞类型之一，负责维持血管的收缩和舒张功能，从而调节血流和血压。脐动脉平滑肌细胞具有与其他血管平滑肌细胞相似的生物学特性，如增殖、迁移、分化和凋亡等。

脐动脉平滑肌细胞在生物医学研究中具有广泛的应用价值。首先，它们可以作为研究心血管疾病发生机制和药物治疗效果的理想模型。心血管疾病是一种常见的疾病，包括冠心病、心肌梗死、高血压等，这些疾病的发生与血管平滑肌细胞的异常增殖、迁移和钙化等过程密切相关。通过体外培养脐动脉平滑肌细胞，科学家们可以模拟这些过程，从而深入研究心血管疾病的发病机制，并评估不同药物对血管平滑肌细胞的影响。

其次，脐动脉平滑肌细胞还可以用于组织工程和再生医学领域的研究。随着组织工程和再生医学的不断发展，科学家们可以利用脐动脉平滑肌细胞构建人工血管或修复受损的血管组织。通过将这些细胞与生物材料相结合，可以形成具有生物活性的血管移植物，用于替代患者体内受损或病变的血管组织，从而恢复血管的正常功能。

在细胞培养方面，脐动脉平滑肌细胞需要特定的培养基和条件来维持其生长和活性。一般来说，这些细胞可以在含有DMEM或RPMI等培养基中生长，其中添加有胎牛血清（FBS）、抗生素和必要的生长因子。细胞的传代和冻存也需要遵循一定的操作规程，以确保细胞的稳定性和可靠性。

Umbilical Artery Smooth Muscle Cells（脐动脉平滑肌细胞）

脐动脉平滑肌细胞培养操作

1)复苏脐动脉平滑肌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)脐动脉平滑肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)脐动脉平滑肌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

脐动脉平滑肌细胞可以用于肾素前体及其受体对人脐动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及其机制的研究

观察PRR在人脐动脉平滑肌细胞中的分布,观察肾素前体及其受体对Umbilical Artery Smooth Muscle Cells（脐动脉平滑肌细胞）增殖的影响及对凋亡蛋白Bcl-2,Bax表达的影响,研究ROS产生和ERK1/2信号通路在其中的作用。

方法： 1.用免疫荧光法观察PRR在脐动脉平滑肌细胞中的分布。

2. 在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,分别以浓度为O.1nM,1nM,10nM的肾素前体干预脐动脉平滑肌细胞24-48h,用CCK-8检测细胞的增殖水平。

3. 在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,分别以浓度为0.1nM,1nM,10nM的肾素前体干预Umbilical Artery Smooth Muscle Cells（脐动脉平滑肌细胞）24h,各组用real-time PCR2及western blot方法检测Bcl-2,Bax蛋白mRNA及蛋白表达水平。

4. 用siRNA PRR转染脐动脉平滑肌细胞24,48及72小时后,用real-time PCR及western blot方法检测PRR的mRNA及蛋白表达,确定转染效率最强时间点。

5. 用siRNA的方法使PRR表达下调后,再用缬沙坦及PD123319预处理30min后,以浓度为10nM的肾素前体干预脐动脉平滑肌细胞24h,分别用CCK-8检测细胞的增殖水平,用real-time PCR及western blot方法检测Bcl-2,Bax蛋白mRNA及蛋白表达水平。

6. 在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,分别以浓度为0.1nM,1nM,10nM的肾素前体干预Umbilical Artery Smooth Muscle Cells（脐动脉平滑肌细胞）24h,然后收集细胞,在流式细胞仪上检测ROS水平。

7. 用siRNA的方法使PRR表达下调后,再用缬沙坦及PD123319预处理30min后,以浓度为10nM的肾素前体干预脐动脉平滑肌细胞24h,在流式细胞仪上检测ROS水平。

8. 在缬沙坦及PD123319阻断AngⅡ的作用下,以浓度为10nM的肾素前体干预脐动脉平滑肌细胞0-60min,用western blot方法检测ERK1/2磷酸化水平。

9. 用DPI(NADPH氧化酶抑制剂)预处理脐动脉平滑肌细胞30min后,再以浓度为10nM的肾素前体干预Umbilical Artery Smooth Muscle Cells（脐动脉平滑肌细胞）,用western blot方法检测ERK1/2磷酸化水平。

10.分别用PD98059(ERK1/2信号通路阻断剂)和DPI预处理脐动脉平滑肌细胞30min后,再以浓度为10nM的肾素前体干预脐动脉平滑肌细胞,用CCK-8检测细胞的增殖,用real-time PCR及western blot方法检测Bcl-2,Bax蛋白mRNA及蛋白表达水平。

参考文献

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