马隐秘杆菌PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

马隐秘杆菌PCR试剂盒是一种专门用于检测马隐秘杆菌的实验工具，采用聚合酶链式反应（PCR）技术进行检测。该试剂盒具有高灵敏度和特异性，能够快速、准确地检测出马隐秘杆菌，对于该病的预防和控制具有重要意义。

马隐秘杆菌是一种常见的病原菌，可引起马脑脊髓炎、马传染性脑脊髓炎等马类动物疾病。感染马隐秘杆菌的马类动物可能会出现神经症状、共济失调、惊厥等症状，严重时可导致死亡。因此，及时检测出马隐秘杆菌对于预防和控制该病的传播具有重要意义。

马隐秘杆菌PCR试剂盒的组成通常包括引物、Taq酶、dNTPs等必要的PCR反应成分，以及可能包含的各种成分如染料、缓冲液、特异性结合探针等。引物是PCR反应的关键成分，它们与马隐秘杆菌基因的特定区域结合，从而启动DNA的扩增过程。Taq酶是一种耐热的DNA聚合酶，能够催化DNA的合成。dNTPs是合成DNA的基本原料。

使用马隐秘杆菌PCR试剂盒进行检测时，首先需要采集感染马隐秘杆菌的马的脑脊液样本。将样本中的DNA或RNA与试剂盒中的引物和Taq酶等成分混合，进行PCR反应。反应过程中，DNA或RNA会不断扩增，最终形成大量的特定基因片段。通过凝胶电泳等技术对这些片段进行分析，可以判断出是否存在马隐秘杆菌基因，从而确定马是否感染该病原菌。

马隐秘杆菌PCR试剂盒具有高灵敏度和特异性，能够在极低浓度下检测出马隐秘杆菌基因。此外，该试剂盒还具有快速、简便、易于操作等特点，可以广泛应用于马类动物疾病的预防和控制领域。然而，试剂盒也存在一定的局限性，如对实验条件和操作要求较高，可能出现假阳性或假阴性结果等问题，需要在使用时注意。

马隐秘杆菌PCR试剂盒

马隐秘杆菌PCR试剂盒的操作步骤如下：

1.样本采集：从患者体内采集血液、粪便、组织等样本，并将其保存在无菌容器中。

2.DNA提取：将采集到的样本进行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取试剂盒。提取后的DNA应保存在-20°C或更低的温度下。

3.PCR反应体系准备：根据马隐秘杆菌PCR试剂盒的要求，配制PCR反应体系，包括引物、荧光探针、dNTPs、DNA聚合酶等。

4.PCR反应：将提取的DNA加入到PCR反应体系中，进行PCR反应。反应条件和时间根据试剂盒说明书的要求进行设置。

5.结果分析：将PCR反应后的产物进行荧光信号检测，根据荧光信号的出现情况判断是否存在隐秘杆菌的感染。

应用^[4-5]

马隐秘杆菌PCR试剂盒可以用于牛源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其PCR检测方法的建立

以致规模化牛场犊牛上呼吸道急性感染的病原检测为出发点,从病死犊牛肺脏等呼吸器官组织中分离出2株细菌。对分离菌进行常规细菌学鉴定(形态特征、染色特性、培养特性及生化特性等)和Biolog自动快速微生物鉴定系统鉴定,结合16SrRNA分析确定分离菌为化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)。小鼠致病性试验显示纯培养物对小鼠致死率较高,药敏试验表明分离菌仅对少数种类抗生素如头孢唑啉、氧氟沙星等敏感,为临床用药提供了参考。

为快速诊断化脓隐秘杆菌感染,建立了检测溶血素(PLO)基因的快速马隐秘杆菌PCR试剂盒PCR方法,敏感性试验显示最低检出菌数为9.2×103CFU/mL,特异性试验表明与其他细菌如布鲁氏菌、大肠杆菌等无交叉反应。重复性试验显示此方法具有良好的重复性和稳定性。在临床检查中,马隐秘杆菌PCR试剂盒PCR检测与传统生化鉴定一致。为研究化脓隐秘杆菌的致病力,相继克隆了该菌的3个毒力因子溶血素(pyolysin,PLO)、胶原结合蛋白(Collagen-Binding Protein,cbpA)(?)口神经氨酸酶(Neuraminidases,nanH)的基因,参考GenBank已经发表的基因序列,设计了7对引物,通过马隐秘杆菌PCR试剂盒PCR分别克隆化脓隐秘杆菌的plo、cbpA、nanH基因,通过序列测定,研究了其与参考毒株的同源性。

结果表明：克隆的plo基因核苷酸序列与GenBank中收录的化脓隐秘杆菌的基因的同源性在98%以上,克隆的cbpA、nanH基因核苷酸序列与GenBank中收录的化脓隐秘杆菌的基因的同源性在85%以上,种系进化树分析结果进一步表明了其与化脓隐秘杆菌属进化结果一致。该菌3个毒力因子的克隆,为在基因水平上探讨细菌毒力因子与细菌致病力的关系提供了物质材料,为分离菌致病性相关研究奠定了基础。本研究成功分离和鉴定了2株化脓隐秘杆菌,数次药敏试验为临床用药提供了依据；分离菌主要毒力因子的克隆和序列分析,为研究毒力因子与细菌致病力的关系提供了基础材料。并在研究毒力因子溶血素的基础上,建立了一种特异、敏感的马隐秘杆菌PCR试剂盒PCR方法,为化脓隐秘杆菌的实验室检测提供了一种快速、准确的方法。

参考文献

[1]Antimicrobial resistance and presence of virulence factor genes in Arcanobacterium pyogenes isolated from the uterus of postpartum dairy cows[J].T.M.A.Santos;;L.S.Caixeta;;V.S.Machado;;A.K.Rauf;;R.O.Gilbert;;R.C.Bicalho.Veterinary Microbiology,2010(1)

[2]Genomic characterization of Arcanobacterium pyogenes isolates recovered from the uterus of dairy cows with normal puerperium or clinical metritis[J]..Veterinary Microbiology,2008(1)

[3]Transcriptional regulation of pyolysin production in the animal pathogen,Arcanobacterium pyogenes[J].Stefani T.Rudnick;;B.Helen Jost;;Stephen J.Billington.Veterinary Microbiology,2008(1)

[4]Molecular identification of Arcanobacterium bialowiezense and Arcanobacterium bonasi based on 16S–23S rRNA intergenic spacer region sequences[J]..Veterinary Microbiology,2008(3)

[5]张明富.牛源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其PCR检测方法的建立[D].东北农业大学,2013.