miRNAsponge抑制载体设计与构建的制备方法

背景及概述^[1]

miRNA是一类由内源基因编码的长度为20~24个核苷酸的非编码单链RNA分子，其在体内参与转录后基因的表达调控。从发现至今已经有1000余种miRNA在人类中鉴定出来。miRNA首先由RNA聚合酶II转录成长达数百个或数千个碱基大小的初始转录子(pri-miRNAs)。初始转录子被含有Drosha(核酸内切酶III)和双链RNA结合蛋白Pasha的复合物剪切为60~70个的miRNA前体(pre-miRNA)。miRNA前体由小分子单体G蛋白Ran-GTP依赖的转运蛋白exportin-5运输至细胞质，被Dicer酶(核酸内切酶)剪切成约22个核苷酸的双链miRNA。双链miRNA被解旋酶解螺旋后，1条链被降解，另1条成为5′端为磷酸基团、3′端为羟基的成熟miRNA。miRNA虽不编码蛋白，但通过对特定mRNA的降解或沉默来实现对特定基因的调控。计算证明，miRNA在一般情况下可以调控上百个基因。然而，每种miRNA在不同环境中的特定功能仍不清楚。

miRNA海绵是一条人为改造的mRNA，其3’非翻译区(UTR)包含若干个在RISC切割位点有几个错配的miRNA靶位点，导致此mRNA在吸附miRNA的同时不会被降解，让miRNA远离其天然的mRNA靶点从而功能出现缺失。作为mRNA，它需由质粒(病毒)载体通过转(感)染进入细胞后介导其在细胞中的表达。相较于化学合成类抑制剂，miRNA海绵可稳定在细胞内表达发挥功能，具有作用效果更加长久的优势。这一方法现被广泛用于miRNA功能缺失转基因动物构建等基础研究领域以及肿瘤靶向治疗的探索研究。如将miRNA海绵序列置于果蝇UAS(upstreamactivesequence，UAS)上游激活序列下游，配合带组织特异性启动子的GAL4基因实现了miRNA在果蝇中组织特异性功能缺失，为在果蝇中研究内源miRNA的功能提供了有力工具。因此miRNAsponge抑制载体设计与构建尤为重要。

制备^[1]

miRNA sponge抑制载体设计与构建中，经特异地优化设计，增强吸附能力的同时增加了更多的结合位点，这样提高了成熟miRNA或siRNA抑制能力，消弱细胞中miRNA或siRNA导致的基因沉默效应，从而进行miRNA或siRNA功能缺失性研究。miRNAsponge抑制载体设计与构建举例如下：一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，包括：

步骤1.多靶向miRNA海绵慢病毒载体系统的设计：根据miRbase中miR-155和miR-31成熟序列分别设计靶向两miRNA成熟序列且第9-11碱基错配的序列，设计一对含有四个错配序列、正反向重叠16个碱基的引物，分别在正、反向引物中引入酶切位点EcoRI和BamHI；

步骤2.构建pCDH-CMV-EGFP-puro质粒；

步骤3.使用步骤1中设计、合成的引物，将正、反向引物退火及延伸，将延伸出的DNA片段酶切后连接进pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，酶切、测序验证质粒，获得分别包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒；

步骤4.通过已有的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒；通过已有的pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒获得pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；

步骤5.构建靶向miR-155和miR-31的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro海绵慢病毒载体：

1)将所述步骤4获得的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒和pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒分别双酶切；

a)为获得插入片段8xmi155sp或8xmi31sp，SalI-HF及BclI双酶切pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒或pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒；

b)为获得载体，SalI-HF及BamHI-HF双酶切pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒或pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒；得到开环的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒或开环的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒；

2)将插入片段8xmi155sp与开环的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro质粒连接；或者将插入片段8xmi31sp与开环的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro质粒连接重组质粒转化感受态细胞，单克隆筛选并酶切验证pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒正确性，获得包含miRNA海绵序列的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒。

主要参考资料

[1] CN201810755754.6一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物审中-实质审查