NCTC1469 小鼠正常肝细胞的应用

背景^[1-3]

NCTC1469小鼠正常肝细胞是一种小鼠正常肝细胞的细胞系，通常用于研究肝脏生物学和药物筛选等。这种细胞系具有稳定的生长特性和形态特征，可以用于实验研究，以了解肝脏细胞的生理和代谢过程等。

NCTC1469小鼠正常肝细胞具有多种特点，例如可以合成和分泌多种生物活性物质，如胆汁酸、白蛋白和凝血因子等；同时，这种细胞系还可以代谢多种药物和毒素，并具有一定的解毒功能。因此，NCTC1469细胞系被广泛应用于药物筛选、肝脏疾病建模和肝再生等方面的研究。

在使用NCTC1469小鼠正常肝细胞进行实验时，需要提供适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度、营养物质和气体环境等。此外，还需要注意细胞的生长状态和物种来源等信息，以确保细胞的健康和稳定性。

NCTC1469小鼠正常肝细胞

NCTC1469小鼠正常肝细胞培养操作

1)复苏NCTC1469小鼠正常肝细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NCTC1469小鼠正常肝细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)NCTC1469小鼠正常肝细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

NCTC1469小鼠正常肝细胞可以用于白藜芦醇对弓形虫感染诱导肝损伤的保护作用及其机制研究

利用刚地弓形虫(简称弓形虫)RH株速殖子,体外感染NCTC1469小鼠正常肝细胞和体内感染BALB/c小鼠,建立体内体外肝损伤模型,探讨白藜芦醇(RSV)对弓形虫感染诱导肝损伤的保护作用及其机制,为弓形虫肝病的防治提供科学依据。

方法:1)体外实验:采用MTS方法,检测不同浓度RSV(12.5～50μM)对NCTC-1469肝细胞的安全浓度。取对数生长期的NCTC1469小鼠正常肝细胞,随机分成5组:正常组(N,未感染+未治疗)、模型组(CN,弓形虫感染+0.1%DMSO治疗)、RSV-12.5μM组[(弓形虫感染+RSV(12.5μM)治疗)]、RSV-25μM组[(弓形虫感染+RSV(25μM)治疗)]及SD组[阳性对照组,(弓形虫感染+SD(100μg/mL)治疗)]。除N组外,其它各组以弓形虫滋养体数:细胞数=5:1的比例感染NCTC-1469肝细胞,感染4 h后,去除游离的弓形虫,各组分别给予相应的药物治疗36 h,收集细胞上清及沉淀用于后续实验。

2) 体内实验:40只雌性BALB/c小鼠随机分成5个组(n=8只/组):正常组(N,未感染+未治疗)、模型组(CN,弓形虫感染+0.5%CMC-Na)、RSV-50组(弓形虫感染+50 mg/kg RSV治疗)、RSV-100组(弓形虫感染+100 mg/kg RSV治疗)和阳性对照组(SD-Na,弓形虫感染+100 mg/kg SD-Na治疗)。除N组外,其余各组均腹腔注射感染3×103个/只弓形虫,建立急性弓形虫感染肝损伤模型。小鼠感染弓形虫4h后,除N组外,其余各组小鼠分别灌胃给予0.2 mL的溶媒或不同浓度的药物,每日一次,连续治疗6天。每日观察并且记录小鼠的发病症状并记录小鼠的存活情况,统计小鼠存活率。在末次给药1h后,小鼠眼球取血,并按常规方法制备血清。给小鼠安乐死后,剥离肝脏组织,右半叶肝脏用于病理切片,左半叶肝脏用于相关指标的检测。

3) 采用定量竞争性聚合酶链式反应(QC-PCR)方法,定量检测各组小鼠肝脏中弓形虫增殖情况;采用苏木精-伊红(HE)染色方法,观察小鼠肝脏病理学形态学变化;采用赖氏法,测定各组小鼠血清及NCTC1469小鼠正常肝细胞上清液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的表达水平;通过蛋白免疫印迹(Western blotting)方法,检测各组NCTC1469小鼠正常肝细胞和小鼠肝组织中TLR4、MyD88、p-NF-KB p65、NF-κB p65、p-κBα、IκBα、TNF-α、iNOS及HMGB1蛋白的表达水平;采用免疫荧光染色方法,检测各组NCTC1469小鼠正常肝细胞中HMGB1与NF-κB p65的核移位情况。

结果:1)RSV能够明显改善弓形虫感染小鼠的发病症状,能够延长弓形虫感染小鼠的存活时间。因此,对弓形虫感染小鼠具有较好的保护作用。2)RSV能够有效地抑制弓形虫感染小鼠肝组织内弓形虫增殖。3)RSV明显抑制弓形虫感染小鼠血清及NCTC1469小鼠正常肝细胞上清液中ALT、AST的表达水平,此外,小鼠肝脏组织HE染色结果显示,RSV能够改善弓形虫感染小鼠肝脏组织的病理学改变。4)RSV抑制弓形虫感染小鼠肝脏组织及NCTC1469小鼠正常肝细胞中TNF-α、iNOS及HMGB1蛋白表达水平,并且阻止HMGB1从细胞核移位至细胞质。

参考文献

[1]Chemotherapeutics for Toxoplasma gondii:Molecular Biotargets,Binding Modes,and Structure-Activity Relationship Investigations.[J].Wu RongZhen;Zhou HuaiYu;Song JingFeng;Xia QiaoHong;Hu Wei;Mou XiaoDong;Li Xun.Journal of medicinal chemistry,2021

[2]Resveratrol modulates Toxoplasma gondii infection induced liver injury by intervening in the HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway.[J].Lu JingMei;Jin GuangNan;Lu YuNan;Zhao XuDong;Lan HuiWen;Mu ShuaiRu;Shen XinYu;Xu GuangHua;Jin ChengHua;Ma Juan;Jin Xuejun;Xu Xiang;Piao LianXun.European journal of pharmacology,2021

[3]HMGB1:An overview of its roles in the pathogenesis of liver disease.[J].Ni YuanAo;Chen Hui;Nie Hao;Zheng Bing;Gong Quan.Journal of leukocyte biology,2021

[4]Resveratrol induces H3 and H4K16 deacetylation and H2A.X phosphorylation in Toxoplasma gondii[J].Contreras Susana M.;Ganuza Agustina;Corvi María M.;Angel Sergio O..BMC Research Notes,2021

[5]鲁京梅.白藜芦醇对弓形虫感染诱导肝损伤的保护作用及其机制研究[D].延边大学,2023.