小鼠白血病细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠白血病细胞通常通过将白血病病毒或其他致癌物质注入小鼠体内来诱导产生。这些白血病细胞具有异常的增殖能力和克隆形成能力，可以快速扩散到全身各个组织和器官。

小鼠白血病细胞在白血病研究中具有重要的应用价值。它们可以用于研究白血病的发病机制，包括基因突变、信号通路异常等。此外，小鼠白血病细胞还可以用于筛选和评估抗白血病药物的疗效，以及开发新的治疗方法。

小鼠白血病细胞是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病，细胞形态类似于正常血细胞或原始幼稚细胞。这种疾病会导致患者出现发热、身体各部位异常出血、淋巴结肿大、肝脾肿大等症状。

在血液肿瘤治疗方面，小鼠白血病细胞已经成为了重要的研究对象。例如，CAR-T细胞疗法已经发挥出了卓越的治疗成果，对于急性淋巴细胞白血病（ALL）和多种淋巴瘤的治疗效果显著。然而，对于急性髓性白血病（AML）的治疗仍然存在一定的挑战，尽管已经找到了一些治疗靶点，但这些靶点在正常的造血干细胞或淋巴祖细胞中也会表达。

小鼠白血病细胞

小鼠白血病细胞培养操作

1)复苏小鼠白血病细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)小鼠白血病细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)小鼠白血病细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

小鼠白血病细胞可以用于RIP3和RIP1敲除对小鼠白血病细胞自噬的影响

以MLL-AF9 AML小鼠白血病细胞为研究对象,研究RIP3和RIP1敲除是否影响小鼠白血病细胞自噬及其作用机制,为深入了解自噬在AML发生发展及耐药机制提供新的理论基础和实验依据。

研究内容主要包括两部分:一、探究RIP3和RIP1敲除是否影响小鼠白血病细胞自噬:我们通过检测WT、RIP3-/-、RIP1-/-小鼠白血病细胞对化疗药的耐药性、细胞的基础自噬水平以及在用化疗药处理后细胞的自噬水平变化和细胞水平上细胞的LC3B变化定位情况来确定RIP3、RIP1与小鼠白血病细胞自噬之间的关系。MTT结果显示RIP3敲除后细胞对所测化疗药的耐药性都有所增强,而RIP1敲除的细胞仅对部分化疗药耐药性增强。蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)结果显示WT、RIP3-/-、RIP1-/-小鼠白血病细胞都具有较高的自噬通量,并且相较于WT,RIP3或RIP1敲除后,自噬水平进一步升高。用不同浓度的化疗药(DNR、Ara-C、CPT)处理细胞或用相同浓度的化疗药DNR处理细胞不同时间后,WB结果显示,用化疗药处理后,相较于WT和RIP1-/-细胞,RIP3敲除后,p62、LC3-II/LC3-I水平升高,并与浓度或时间成反比。双荧光自噬检测显示相较于WT,RIP3-/-多为后期自噬,自噬流未被抑制;而RIP1-/-细胞则为早期自噬,自噬流遭到少量抑制。

二. 探究RIP3和RIP1调控小鼠白血病细胞自噬的具体机制:我们通过检测细胞增殖速度、细胞DNA损伤水平、细胞在化疗药处理时RIP3、RIP1蛋白水平变化以及RIP3、RIP1与p62蛋白的相互作用来探索RIP3、RIP1调控小鼠白血病细胞自噬的机制。免疫荧光显示,相较于c-Kit+细胞,WT、RIP3-/-、RIP1-/-小鼠白血病细胞都有很高的DNA损伤水平。用化疗药DNR(100n M)处理WT、RIP3-/-、RIP1-/-小鼠白血病细胞不同时间后,WB检测RIP3、RIP1表达水平,结果显示用药时间增加,RIP3、RIP1蛋白表达量也逐渐增加,用CQ抑制自噬后,RIP3、RIP1蛋白表达量明显减少。Co-IP结果显示RIP3和RIP1都能与p62蛋白相互作用。

综上所述,得出三点结论:1、MLL-AF9 AML小鼠白血病细胞由于增殖速率异常造成DNA损伤过高,这引起细胞本身就具有较高的自噬水平。

2、RIP3能够结合p62蛋白抑制小鼠白血病细胞从早期自噬转向晚期自噬,RIP1能够结合p62蛋白促进小鼠白血病细胞从早期自噬转向晚期自噬,并且RIP3的表达依赖于RIP1。

3、RIP3、RIP1可能参与由DNA损伤介导的自噬转录调控通路,具体机制还亟需进一步探索。

参考文献

[1]RIPK3 signaling and its role in the pathogenesis of cancers..Liu Shanhui;Joshi Kanak;Denning Mitchell F;Zhang Jiwang.Cellular and molecular life sciences:CMLS,2021

[2]Recent progress on targeting leukemia stem cells..Ma XiangYu;Wei Liuya;Lei Zining;Chen Yanglu;Ding Zhiyong;Chen ZheSheng.Drug discovery today,2021

[3]Leukaemia:a model metastatic disease..Whiteley Andrew E;Price Trevor T;Cantelli Gaia;Sipkins Dorothy A.Nature reviews.Cancer,2021

[4]Emerging agents and regimens for AML.Liu Hongtao.Journal of Hematology&Oncology,2021

[5]冯澜耀.RIP3和RIP1敲除对小鼠白血病细胞自噬的影响[D].上海师范大学,2022.