人皮肤成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

人皮肤成纤维细胞是一种常见的人体细胞类型，主要存在于皮肤、结缔组织和血管壁等处。它们是维持组织结构和功能的重要细胞类型，具有以下几个主要功能：

1.合成胶原蛋白：成纤维细胞是胶原蛋白的主要合成细胞，胶原蛋白是皮肤、骨骼、肌腱等结缔组织的主要成分，对于维持组织的弹性和稳定性具有重要作用。

2.产生基质分子：成纤维细胞能够产生多种基质分子，如纤维连接蛋白、弹性纤维等，这些分子对于维持组织的机械强度和稳定性具有重要作用。

3.参与伤口愈合：在伤口愈合过程中，成纤维细胞能够迁移到伤口处，合成胶原蛋白和其他基质分子，促进伤口的愈合和修复。

4.调节免疫反应：成纤维细胞能够分泌多种细胞因子和趋化因子，参与调节免疫反应和炎症反应。

5.老化和疾病相关：随着年龄的增长，成纤维细胞的功能逐渐下降，导致皮肤松弛、皱纹增多等老化现象。此外，一些疾病如硬皮病、纤维化等也与成纤维细胞的功能异常有关。

人皮肤成纤维细胞

人皮肤成纤维细胞培养操作

1)复苏人皮肤成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人皮肤成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人皮肤成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

人皮肤成纤维细胞可以用于柴达木黑果枸杞花青素对UVB辐射体外培养人皮肤成纤维细胞的衰老及p53、p21影响的研究

1. 建立UVB辐射诱导HSFs细胞的早衰模型;2.研究柴达木黑果枸杞花青素对UVB辐射损伤体外人HSFs的早衰进程有无干预作用,同时探讨其发挥干预早衰进程的作用机制。

方法:取处于对数生长期的第3代至第5代的人皮肤成纤维细胞,分为空白对照组、UVB照射组、黑枸杞花青素100ug/ml+UVB照射组、黑枸杞花青素500ug/ml+UVB照射组、黑枸杞花青素1000ug/ml+UVB照射组。除对照外,其余各组按照以上进行照光和(或)药物处理,在花青素干预24小时后连续3天进行照光处理,照光完成后继续培养细胞72小时。(1)使用SA-β-Gal染色剂对老化细胞染色,借助光学显微镜确认染色情况并计算染色阳性的老化细胞数;(2)用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)计算各组衰老关联基因p53、p21表达量。

结果:1.成功建立UVB辐射诱导HSFs的早衰模型;

2. 柴达木黑果枸杞花青素可以减轻UVB辐射诱导HSFs的早衰。同空白组比较,UVB放射组HSFs衰老细胞数大幅度增加,SA-β-Gal染色阳性率显著升高(P<0.01)。与UVB照射组比较,经柴达木黑果枸杞花青素干预的各实验组SA-β-Gal染色阳性率降低(P<0.05),且随着药物浓度的增加其阳性率降低越明显。

3. 柴达木黑果枸杞花青素可以下调UVB辐射HSFs后衰老相关基因p53、p21的表达,与UVB照射组比较,经不同浓度达木黑果枸杞花青素干预的各实验组衰老基因p53、p21表达随药物浓度的升高而降低(P<0.05)。

结论:柴达木黑果枸杞花青素可抑制UVB辐射诱导HSFs的早衰进程,具有光保护作用,其分子机制可能是通过下调p53、p21的表达水平减轻HSFs的紫外线损伤。

参考文献

[1]Effects of long-term intake of anthocyanins from Lycium ruthenicum Murray on the organism health and gut microbiota in vivo.Yujia Peng;;Yamei Yan;;Peng Wan;;Wei Dong;;Kaiyin Huang;;Linwu Ran;;Jia Mi;;Lu Lu;;Xiaoxiong Zeng;;Youlong Cao.Food Research International,2020

[2]Reversine inhibits MMP-1 and MMP-3 expressions by suppressing of ROS/MAPK/AP-1 activation in UV-stimulated human keratinocytes and dermal fibroblasts..Kim Jeong-Mi;;Kim Sun Young;;Noh Eun-Mi;;Song Hyun-Kyung;;Lee Guem-San;;Kwon Kang-Beom;;Lee Young-Rae.Experimental dermatology,2018

[3]DNA damage responses and p53 in the aging process..Ou Hui-Ling;;Schumacher Björn.Blood,2018

[4]Accelerated senescence in skin in a murine model of radiation-induced multi-organ injury..McCart Elizabeth A;;Thangapazham Rajesh L;;Lombardini Eric D;;Mog Steven R;;Panganiban Ronald Allan M;;Dickson Kelley M;;Mansur Rihab A;;Nagy Vitaly;;Kim Sung-Yop;;Selwyn Reed;;Landauer Michael R;;Darling Thomas N;;Day Regina M.Journal of radiation research,2017

[5]魏丽.柴达木黑果枸杞花青素对UVB辐射体外培养人皮肤成纤维细胞的衰老及p53、p21影响的研究[D].青海大学,2022.