大鼠气管上皮细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠气管上皮细胞是一种在实验室研究中常用的细胞类型。这些细胞通常来自大鼠的气管组织，并被培养在实验室中以研究各种生理和病理过程。

在近端下呼吸道的上皮表面，主要是纤毛上皮细胞，它与基底细胞及杯状细胞一起构成假复层上皮，到达气管腔。

这些细胞可以用于各种实验，例如药物筛选、毒理学测试、免疫学研究等。然而，需要注意的是，这些细胞是经过人工培养的，可能存在一些与天然组织不同的特性。

大鼠气管上皮细胞

大鼠气管上皮细胞培养操作

1)复苏大鼠气管上皮细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠气管上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠气管上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

大鼠气管上皮细胞可以用于苯并（a）芘对大鼠气管—支气管上皮细胞p16、RASSF1A基因甲基化的影响

观察不同浓度的苯并(a)芘在不同时间对原代培养的大鼠气管上皮细胞p16、RASSF1A基因启动子区甲基化程度的影响。

方法(1)采用组织块培养法培养原代大鼠气管上皮细胞；

(2) 噻唑兰(MTT)还原实验检测系列苯并(a)芘浓度和不同作用时间对原代大鼠气管上皮细胞增殖活性的影响；

(3) 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测不同浓度的苯并(a)芘对原代大鼠气管上皮细胞p16、RASSF1A基因启动子区甲基化程度的影响。

结果(1)在本实验室首次成功建立了用组织块培养法培养原代大鼠气管上皮细胞的方法；

(2) MTT实验结果显示苯并(a)芘浓度在10.0μmol/L及以下时，72h内大鼠气管上皮细胞抑制率均小于50%，具有明显的抑制增殖作用，并呈剂量依赖性；

(3) 以0.1、1.0、10μmol/L的苯并(a)芘分别处理原代大鼠气管上皮细胞24h、48h、72h后，发现p16和RASSF1A基因启动子区均未发生甲基化，并通过测序验证。

结论(1)组织块培养法是培养原代大鼠气管-支气管上皮细胞的较好方法，方法简便，易操作；

(2) 苯并(a)芘对大鼠气管-支气管上皮细胞的毒性随着苯并(a)芘浓度的增大而增大，具有明显的抑制增殖作用，并呈剂量依赖性；

(3)0.1、1.0、10μmol/L的苯并(a)芘对原代大鼠气管-支气管上皮细胞分别作用24h、48h、72h，不会引起p16、RASSF1A基因启动子区甲基化。

参考文献

[1]miR-320 targets transferrin receptor 1(CD71)and inhibits cell proliferation.Dale G.Schaar;;Daniel J.Medina;;Dirk F.Moore;;Roger K.Strair;;Yi Ting.Experimental Hematology,2009

[2]Cancer is a Preventable Disease that Requires Major Lifestyle Changes.Preetha Anand;;Ajaikumar B.Kunnumakara;;Chitra Sundaram;;Kuzhuvelil B.Harikumar;;Sheeja T.Tharakan;;Oiki S.Lai;;Bokyung Sung;;Bharat B.Aggarwal.Pharmaceutical Research,2008

[3]siRNA Targeting against EGFR,a Promising Candidate for a Novel Therapeutic Application to Lung Adenocarcinoma.Yamanaka,Sumitaka;Gu,Zhaodi;Sato,Masami;Fujisaki,Rumi;Inomata,Kenichi;Sakurada,Akira;Inoue,Akira;Nukiwa,Toshihiro;Kondo,Takashi;Horii,Akira.Pathobiology,2008

[4]Dynamic Regulation of Histone Lysine Methylation by Demethylases.Yang Shi;;Johnathan R.Whetstine.Molecular Cell,2007

[5]吕晓丽.苯并（a）芘对大鼠气管—支气管上皮细胞p16、RASSF1A基因甲基化的影响[D].内蒙古医科大学,2014.