二氢丹参酮I的应用

背景及概述^[1]

丹参，为唇形科植物丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)的干燥根及根茎，最早记载于《神农本草经》。丹参味苦、性微寒，有活血祛瘀、安神宁心之传统功效。植物化学研究显示，丹参的化学成分主要包括脂溶性和水溶性两部分。丹参酮类是丹参中的主要脂溶性成分，是具有橙黄色或橙红色特征的松香烷型二萜类化合物。药理研究证明，丹参酮类化合物具有抗氧化、抗菌及抗肿瘤方面的作用。二氢丹参酮I(DihydrotanshinoneI，简称DHT)是丹参酮大家族的一员，其分子式为C18H14O3，分子量为278.3。研究显示，DHT具有抗肿瘤、心血管保护的药理活性。

应用^[1-3]

二氢丹参酮I是丹参根茎的提取物，丹参是临床中最常用的活血化瘀的中药，相关文献报道丹参具有增加冠脉血流量、扩张冠状动脉、防止心肌缺血等心血管作用，以及用于治疗胃癌癌、肝癌、宫颈癌等多种疾病。实验显示二氢丹参酮I(DHT)能有效改善实验性溃疡性结肠炎小鼠的包括体重下降、腹泻、血便和精神状态等多方面的一般状态，明显改善病理变化、显著减轻炎症反应、降低血浆炎症因子的水平等，显示出DHT具有明显的抗溃疡性结肠炎作用。二氢丹参酮I治疗溃疡性结肠炎的优点在于作用迅速、疗效确切且药效良好。此外，二氢丹参酮I为丹参中提取的天然成分，在实验过程中未见明显副作用及毒性反应，揭示了二氢丹参酮I是一种安全有效的抗溃疡性结肠炎的药物。

此外，氢丹参酮I是丹参中最主要的抗肿瘤成分，并且二氢丹参酮I对人体正常细胞毒性较小，游研究主要是检测二氢丹参酮I对卵巢癌的抑制作用机制，证明二氢丹参酮I抑制卵巢癌的增殖及转移，为临床治疗卵巢癌提供了新的策略。采用MTT法检测体外培养的A2780和OV2008细胞的生长与增殖情况；采用划痕和侵袭实验检测二氢丹参酮I对A2780和OV2008细胞转移能力的影响；采用基因芯片技术检测A2780细胞经过二氢丹参酮I处理后的基因变化情况；根据目的基因PIK3CA的碱基序列，设计特异的过表达质粒及无关(NC)序列，通过lipofectamin2000脂质体法瞬时转染A2780细胞，获得PIK3CA表达上调的细胞模型，Westernblot方法检蛋白表达情况；qPCR和Westernblot方法检测细胞中目的基因的mRNA及蛋白质水平的表达情况；采用MTT法和克隆形成实验比较二氢丹参酮I对A2780细胞与上调PIK3CA的A2780细胞生长和增殖得变化情况；采用划痕和侵袭实验比较二氢丹参酮I对A2780细胞与上调PIK3CA的A2780细胞的转移能力。结果显示：1）MTT验证了二氢丹参酮I对A2780和OV2008细胞的增殖抑制作用，其抑制作用具有时间和剂量依赖关系。2）划痕与侵袭实验证明二氢丹参酮I对A2780与OV2008的转移具有抑制作用。3）基因芯片结果显示经二氢丹参酮I处理后A2780细胞中PIK3CA、DDB2、HGF等增殖与转移相关基因下调。4）利用脂质体瞬时转染技术，成功获得PIK3CA表达上调的细胞模型，PIK3CA表达上调组细胞受二氢丹参酮I后的生长和增殖抑制作用明显低于对照组细胞。5）PIK3CA表达上调组细胞受二氢丹参酮I后的转移抑制作用明显低于对照组细胞。因此研究结果表明二氢丹参酮I通过下调PIK3CA的表达影响PI3K/AKT信号通路抑制卵巢癌细胞的增殖与转移。二氢丹参酮I治疗癌症具有潜在的临床意义。

另外，二氢丹参酮Ⅰ(DHT)具有预防实验性动脉粥样硬化(AS)的作用。研究采用灌胃给药，每日1次，总计连续给药12周。正常组及模型组给予等量的1%吐温-80作为对照。12周后，测定空腹血糖(FBG)、体重和腹围。测定血清总胆固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量。取主动脉，进行油红O染色和HE染色。免疫组化检测动脉壁凝集素样氧化型低密度脂蛋白受-1(LOX-1)、NADPH氧化酶4(NOX4)及核转录因子-kappaBp65(，NF-κBp65)的表达；免疫荧光检测动脉壁LOX-1的表达。结果显示两个剂量DHT对AS模型的FBG、体重和腹围均无明显影响。与模型组相比，DHT高剂量显著降低血清TC、TG、LDL-C水平，明显增加血清中SOD和GSH含量，明显降低MDA含量。油红O和HE染色结果表明，对照组主动脉管腔内壁光滑，未见异常；模型组动脉内膜增厚，呈现橙红色脂质浸润和泡沫细胞坏死形成的空泡；DHT组脂质浸润明显减少，空泡面积缩小甚至消失。免疫组化和免疫荧光结果显示DHT可显著降低动脉壁NOX4、NF-κBp65和LOX-1的表达。结论：DHT对实验性AS具有一定的预防作用，其机制与降低血清中脂质水平和ROS水平有关，同时抑制NOX4、NF-κBp65和LOX-1在斑块区域中的表达。

制备^[4]

一种采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法，包括以下步骤：

步骤A：提取：将丹参药渣粉碎后过筛得到丹参药渣粉末，加入乙醇溶液，进行回流提取2～3次，每次1～2小时，合并提取液并浓缩得到丹参醇提物浸膏；

步骤B：萃取除杂：取步骤A制备得到的丹参醇提物浸膏，加纯水溶解，分别用石油醚和乙酸乙酯依次萃取，反复萃取三次，合并乙酸乙酯部位提取液，减压浓缩，得乙酸乙酯部位浓缩液；

步骤C：中压制备液相纯化：称取步骤B制备得到的乙酸乙酯部位浓缩液加入硅胶搅拌均匀，然后装入中压进样器中，选择石油醚和乙酸乙酯为流动相，设置流动相流速为15～20mL/min，进行中压制备液相纯化；

步骤D：采用UPLC分析步骤C的中压制备液相洗脱物，然后合并丹参酮IIA和二氢丹参酮I部位：

步骤E：高压制备液相纯化：取步骤D合并的丹参酮IIA和二氢丹参酮I部位，浓缩，加入甲醇溶解，用0.22μm滤膜过滤后进高压制备液相纯化，选择甲醇和超纯水为流动相，梯度洗脱，经高压制备液相纯化得丹参酮IIA和二氢丹参酮I。

主要参考资料

[1] CN201710711874.1二氢丹参酮Ⅰ在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

[2] 二氢丹参酮Ⅰ抑制卵巢癌增殖与转移作用的机制研究

[3] 二氢丹参酮Ⅰ预防实验性动脉粥样硬化作用的初步研究

[4] CN201710026412.6采用中、高压制备液相法制备丹参酮IIA和二氢丹参酮I的方法