MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系是一种来源于人类乳腺癌的细胞系，它最初是由美国国立癌症研究所(NCI)于1970年代从一名患有乳腺癌的女性体内分离出来的。这种细胞系在实验室中被广泛用于研究乳腺癌的发生、发展和治疗。

MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系

MDA-KB2细胞系的特点包括：

贴壁生长：MDA-KB2细胞系可以在含有血清的培养基中贴壁生长，形成单层或多层的细胞群落。

异质性：MDA-KB2细胞系具有较高的异质性，即不同克隆的细胞在形态、生长速度和基因表达等方面存在差异。

耐药性：MDA-KB2细胞系对多种化疗药物具有耐药性，这使得它成为研究乳腺癌耐药机制的重要工具。

基因突变：MDA-KB2细胞系中存在多个已知的致癌基因突变，如TP53、PIK3CA等。这些突变可能与该细胞系的恶性转化有关。

MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4-5]

MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系可以用于邻苯二甲酸酯类化学物的内分泌干扰效应

利用受体介导的报告基因试验检测邻苯二甲酸酯类化学物内分泌干扰效应

应用雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)以及甲状腺激素受体(TR)介导的MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系报告基因试验检测三种邻苯二甲酸酯类化学物:邻苯二甲酸乙基己基酯(DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸单丁酯(MBP)的拟或(抗)雌激素、雄激素和甲状腺激素活性,并对三种化学物的激素干扰效应进行比较。

方法1.雌激素受体介导的报告基因试验:将表达大鼠ERα的质粒rERα/pCI与重组Luc报告基因质粒pERE-aug-Luc共转染CV-1细胞。根据受试化学物能否诱导Luc的表达,以及能否拮抗E2诱导的Luc的表达,判断受试化学物的ER激动和拮抗效应。

2. 雄激素受体介导的报告基因实验:应用稳定转染了pMMTV-Luc的MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系,将受试化学物单独染毒细胞,以及与AR拮抗剂氟他胺(Flu)共同染毒,检测Luc的表达情况,判断受试化学物的AR激动效应,将受试化学物与双氢睾酮(DHT)共同染毒,检测其AR拮抗效应。

3. 甲状腺激素受体介导的报告基因试验:将表达人TRβ配体结合域和Gal4-BD(酵母转录因子结合域)融合蛋白的质粒pGal4-L-TRβ与Gal4反应的报告基因质粒pUAS-tk-luc共转染CV-1细胞,根据该物质能否诱导Luc的表达以及拮抗T3诱导的Luc表达,判断受试化学物的TR激动作用和拮抗作用。

结果1.雌激素受体介导的报告基因试验:三种邻苯二甲酸酯类化学物中DEHP和MBP几乎不能诱导Luc的表达,与对照组相比无统计学差异,DBP在高浓度能诱导Luc的表达,最高诱导倍数为溶剂对照的2.6倍。三种邻苯二甲酸酯类化学物均无法抑制10-9 M E2所诱导的Luc表达。

2. 雄激素受体介导的报告基因实验:DBP、MBP和DEHP均可以诱导MDA-KB2人正常乳腺贴壁细胞系Luc的表达,EC50分别为6.17×10^-6、1.13×10^-5和大于10^-4 M。将三种化学物与10^-5 M Flu共同染毒,三种化学物诱导的Luc表达均被抑制。代谢产物MBP比DBP表现出更强的活性。DBP、MBP和DEHP均能抑制10^-9 M DHT所诱导的Luc的表达,IC50分别为1.05×10⁶、1.22×10⁷和大于10⁴ M,抑制效应强度:DEHP<DBP<MBP。

3. 甲状腺激素受体介导的报告基因试验:DBP、MBP和DEHP均能抑制5×10^-9 M T3所诱导的Luc的表达,IC50分别为1.31×10⁵,2.77×10⁶和大于10⁴ M,三种化学物的抑制效应强度:DEHP<DBP<MBP。三种邻苯二甲酸酯类化学物均不能诱导Luc的表达。

结论1.所研究的三种邻苯二甲酸酯类化学物中DEHP、MBP无拟雌激素活性,DBP表现出较弱的拟雌激素活性。该三种化学物均无抗雌激素活性。

2. 三种邻苯二甲酸酯类化学物均具有拟雄激素活性,其活性强度:DEHP<DBP<MBP,其中代谢产物MBP表现出比原型DBP更强的拟雄激素活性。三种邻苯二甲酸酯类化学物均具有抗雄激素活性,其活性强度:DEHP<DBP<MBP,其中代谢产物MBP表现出比原型DBP更强的抗雄激素活性。

3. 三种邻苯二甲酸酯类化学物均具有抗甲状腺激素活性,其活性强度:DEHP<DBP<MBP,其中代谢产物MBP表现出比原型DBP更强的抗甲状腺激素活性。三种邻苯二甲酸酯类化学物均无拟甲状腺激素活性。

参考文献

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[5]沈欧玺.邻苯二甲酸酯类化学物的内分泌干扰效应[D].南京医科大学,2012.