皮炎外瓶霉PCR试剂盒的应用

背景^[1-3]

皮炎外瓶霉PCR试剂盒是一种用于检测皮炎外瓶霉的荧光定量PCR试剂盒。

皮炎外瓶霉PCR试剂盒具有即开即用的特点，用户只需要提供病毒样品，无需进行复杂的前处理。试剂盒中的引物是根据皮炎外瓶霉保守序列设计的，具有专一性，与相关病毒无交叉反应。此外，该试剂盒的灵敏度可以达到几百拷贝/反应，具有较高的检测精度。同时，采用一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。

皮炎外瓶霉

使用皮炎外瓶霉PCR试剂盒进行检测时，首先需要采集患者的皮肤样本，然后按照说明书上的步骤进行DNA提取和PCR扩增反应。最后，通过荧光探针检测PCR产物中的特定序列来确定是否存在外瓶霉感染。这种方法具有高灵敏度和特异性，可以快速准确地诊断皮炎外瓶霉感染。

样本采集、存放及运输方面，需要按照常规方法采集各类型样本，并在2~8℃条件下保存不超过72小时，或者在-70℃以下长期保存，但应避免反复冻融。运输时，应采用泡沫箱加冰密封进行。

皮炎外瓶霉菌落早期呈酵母样，环形或卵圆形，逐渐转为小羊皮样，橄榄灰色菌伴气生菌丝，常有棕色色素渗入琼脂，最高生长气温为42℃。镜下孢子呈透明状，壁薄，成熟后壁厚。皮炎外瓶霉可从植物和土壤中分离出来，是引起中枢神经系统暗色丝孢病最常见致病菌，免疫缺陷，化疗，器官移植或艾滋病是本病的高危因素，但多数病例也无免疫缺陷前提或诱因。此外该菌还可引起皮肤（足菌肿或皮肤暗色丝孢霉病）或肺部感染。

应用^[4-5]

皮炎外瓶霉PCR试剂盒可以用于恩波吡维铵单用及与唑类联合抗皮炎外瓶霉、烟曲霉的作用

目的1.明确恩波吡维铵(Pyrvinium Pamoate,PP)在皮炎外瓶霉对ExtrR的影响;明确ExtrR在皮炎外瓶霉生长、毒力及体外药物敏感性中的作用;阐明ExtrR在PP单用及与唑类联合抗皮炎外瓶霉中的调控机制。

2. 筛选烟曲霉敲除株菌库中影响PP联合唑类协同效应的相关靶点。

3. 进一步分析烟曲霉敲除菌库中新型ABC转运蛋白ROA1在烟曲霉对唑类药物敏感性、生长和氧化应激的影响。

方法1.采用电穿孔法构建皮炎外瓶霉敲除株△ExtrR;运用微量液基稀释法检测PP与唑类联合的体外药物敏感性;运用E-test药物敏感性实验检测其对唑类药物的敏感性;通过生长曲线测定、菌落直径测量、真菌形态观察(小培养)等实验明确ExtrR在皮炎外瓶霉生长、毒力中的作用。

2. 参考美国临床实验室标准化研究所CLSI M38-A2、M44-A2方案,利用微量液基稀释棋盘法检测PP联合伊曲康唑(Itraconazole,ITR),伏立康唑(Voriconazole,VOR)、泊沙康唑(Posaconazole,POS)的体外协同抗菌效应,筛选烟曲霉敲除菌库中逆转PP协同唑类菌株。进一步明确PP协同唑类抗真菌作用机制。

3. 利用高通量基因敲除技术制备原生质体法构建烟曲霉敲除株△ROA1,检测其对唑类药物体外药物敏感性;通过真菌形态观察(小培养)、渗透压测定、细胞内活性氧试验测定、氧化应激试验测定等实验明确△ROA1在烟曲霉生长、毒力中的作用;通过皮炎外瓶霉PCR试剂盒RT-PCR技术检测cyp51及MDR1、CDR1b、Srb A、Atr R等基因的表达,明确△ROA1耐药机制。

结果1.与皮炎外瓶霉34野生株(WT)相比,△ExtrR敲除株较皮炎外瓶霉野生株WT生长缓慢;菌落直径无明显差异;E-test药物敏感性实验显示:ITR、VOR、POS对△ExtrR的MIC值均小于WT,△ExtrR对VOR的敏感性与野生株相比显著增强,有统计学意义(P<0.05);△ExtrR对ITR、POS的敏感性与野生株相比差异无统计学意义(P>0.05);PP与唑类联合药敏实验显示△ExtrR敲除株与野生株在体外均有协同POS抗真菌作用。

2. 微量液基棋盘法从烟曲霉敲除菌库中筛选出氧化还原酶,短链脱氢酶/还原酶家族超家族氧化物相关基因AFUA＿8G01550、MFS转运体相关基因。

3. AFUA＿2G05840、SET和WW结构域蛋白AFUA＿5G06000、FAD依赖性氧化还原酶相关基因AFUA＿7G05070敲除株可以逆转PP协同POS抗真菌作用。

4.与烟曲霉野生株WT相比,真菌形态观察(小培养)显示△ROA1较野生株产孢率较低;微量液基稀释法药敏实验显示△ROA1对ITR、VOR敏感性降低,差异有统计学意义(P<0.05);E-test药物敏感性实验显示:△ROA1对ITR、VOR、POS的MIC值均大于WT,但差异无统计学意义(P>0.05)。渗透压测定显示:在加入Na Cl后△ROA1和WT的菌落直径之间无明显差异(P>0.05)。而在加入D-山梨醇之后,△ROA1的菌落直径明显大于野生株,对D-山梨醇敏感性下降,存在显著差异(P<0.05)。细胞内活性氧试验测定显示:△ROA1和WT产生的活性氧无明显差异(P>0.05)。氧化应激试验测定显示:过氧化氢组△ROA1和WT的菌落直径在0m M、0.2m M、2.5m M有显著差异(P<0.05),△ROA1菌落直径显著大于WT;甲萘醌组在0μM、5μM、15μM△ROA1菌落直径显著大于WT(P<0.05)。皮炎外瓶霉PCR试剂盒RT-PCR显示:△ROA1的cyp51B、MDR4、Srb A基因表达量显著增加(P<0.05)。

结论1.在皮炎外瓶霉中ExtrR的缺失突变体△ExtrR对VOR的敏感性增强,ExtrR可能还影响了皮炎外瓶霉的生长速率及菌株形态;目前的实验结果尚不足以证明ExtrR参与了皮炎外瓶霉PP协同唑类抗真菌作用的机制,PP协同唑类抗皮炎外瓶霉的具体调控机制还有待进一步研究。

2.短链脱氢酶/还原酶家族超家族氧化物相关基因AFUA＿8G01550、MFS转运体相关基因AFUA＿2G05840、SET和WW结构域蛋白AFUA＿5G06000、FAD依赖性氧化还原酶相关基因AFUA＿7G05070可能为PP协同POS抗烟曲霉作用靶点。

参考文献

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[2]Exophiala dermatitidis..Usuda Daisuke;Higashikawa Toshihiro;Hotchi Yuta;Usami Kenki;Shimozawa Shintaro;Tokunaga Shungo;Osugi Ippei;Katou Risa;Ito Sakurako;Yoshizawa Toshihiko;Asako Suguru;Mishima Kentaro;Kondo Akihiko;Mizuno Keiko;Takami Hiroki;Komatsu Takayuki;Oba Jiro;Nomura Tomohisa;Sugita Manabu.World journal of clinical cases,2021

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[5]谭丽华.恩波吡维铵单用及与唑类联合抗皮炎外瓶霉、烟曲霉的作用[D].长江大学,2022.